黃文濤，肖柳，程璐，張耕，楊全偉

(1.武漢市第一醫(yī)院藥學部，武漢 430022；2.武漢市中醫(yī)醫(yī)院腫瘤科，武漢 430022)

2011年的流行病學調查中發(fā)現(xiàn)：60%的婦女中有重度原發(fā)痛經(jīng)，其中51%的痛經(jīng)婦女日常生活受到影響，17%的重度痛經(jīng)患者因痛經(jīng)而缺工或缺課，因此近年來醫(yī)學界對痛經(jīng)的治療和研究較為關注。芩術痛經(jīng)巴布劑可以很好地抑制子宮平滑肌痙攣，降低子宮平滑肌過度興奮性，對原發(fā)性痛經(jīng)具有良好的治療效果。鑒于巴布劑具有基質載藥量大，皮膚相容性好、藥物釋放平穩(wěn)，藥效持久，貼敷無過敏性及刺激性的特點，將其開發(fā)為貼敷舒適，不良反應少、經(jīng)濟方便的巴布劑[1-2]。為了考察該制劑的透皮率，筆者通過超臨界提取技術，得超臨界黃芩、白術混合提取物，制備成巴布劑，以制劑中主藥黃芩中主要成分為研究對象，以黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素的含量為考察指標，研究芩術痛經(jīng)巴布劑的透皮性能，從而為臨床用藥提供依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1儀器 高效液相色譜儀：Waters e2695型色譜儀，紫外檢測器：Waters 2489；島津LC-16型色譜儀，SPD-16，紫外檢測器：依利特色譜柱Extend C18分析柱(4.6 mm×200 mm，5 μm)；艾柯超純水機(EXCEED 型，成都艾柯水處理有限公司)；電子天平：德國Sartorius ME215S(Max210 g，d=0.01 mg)；RYJ-6A型藥物透皮擴散實驗儀(上海黃海藥檢儀器廠)。

1.2試劑 黃芩苷對照品(批號：110715-200212，純度為100%)，黃芩素對照品(批號：111545-200604，純度為98.5%)，漢黃芩素對照品(批號：111514-200403，純度為98.5%)，購于中國食品藥品檢定研究院；芩術痛經(jīng)巴布劑自制(批號：171220)；乙腈(色譜純，美國Tedia Company)；乙醇、甲醇(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；磷酸(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；水為純化水。

1.3實驗動物 SPF級雌性小鼠，體質量(20±5) g，由湖北省疾病控制中心動物實驗室提供，合格證號：4200695787，實驗動物許可證號：SCXK(鄂)2008-0030。

2 方法與結果

2.1色譜條件 色譜柱：島津柱Wonda Sil C18分析柱(4.6 mm×200 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.1%磷酸水(25：75)；柱溫30 ℃；流速1.0 mL·min-1；進樣20 μL；檢測波長280 nm。

2.2對照品溶液的制備

2.2.1混合對照品溶液的制備 精密量取黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素對照品12.41，11.25，11.03 mg，分別置于50 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，分別得黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素對照品溶液。精密吸取上述對照品溶液各10 mL，置于50 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得混合對照品儲備液。

2.2.2缺黃芩苷混合對照品溶液的制備 精密吸取上述黃芩素、漢黃芩素對照品溶液各1 mL，置于5 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得缺黃芩苷混合對照品。

2.2.3缺黃芩素混合對照品溶液的制備 精密吸取上述黃芩苷、漢黃芩素對照品溶液各1 mL，置于5 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得缺黃芩素混合對照品。

2.2.4缺漢黃芩素混合對照品溶液的制備 精密吸上述黃芩苷、黃芩素對照品溶液各1 mL，置于5 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得缺漢黃芩素混合對照品。

2.3供試品溶液的制備 稱取比例的黃芩、白術藥材，在優(yōu)選的萃取壓力為35 MPa，萃取溫度為30 ℃，采用超臨界二氧化碳萃取，所得萃取物溶于去離子水中，混合均勻作為步驟①；向步驟①中加入亞硫酸氫鈉、乙二胺四乙酸、檸檬酸、卡波姆，混合均勻作為步驟②；取聚丙烯酸鈉NP700溶于丙三醇中作為步驟③；取高嶺土、甘羥鋁、山梨醇、二氧化鈦，混合均勻作為步驟④；將步驟④制備的組合物加入步驟③的組合物中，混合均勻作為步驟⑤；將步驟⑤制備的組合物加入到步驟②制備的組合物中，放置熟化，涂布于背襯層無紡布上，加蓋防粘層聚乙烯薄膜，避光通風處自然晾干，即為自制的芩術痛經(jīng)巴布劑。取自制的芩術痛經(jīng)巴布劑(批號：171220)，除去蓋襯，稱取該制劑約1.5 g(含黃芩生藥量0.40 g)，精密稱定，置于50 mL錐形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，稱質量，超聲處理(140 W，頻率42 kHz)30 min，靜置放冷后再稱定質量，用70%乙醇補充質量，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4缺黃芩的巴布劑制備 取白術藥材，按上述“2.3”項制備方法，作為陰性供試品。

2.5專屬性考察 取黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素混合對照品、缺黃芩苷、缺黃芩素、缺漢黃芩素混合對照品、芩術痛經(jīng)巴布劑樣品及白術超臨界提取物供試品作為陰性樣品，分別進樣20 μL，分別記錄色譜圖，見圖1。對照品溶液和供試品溶液的特征峰在保留時間上分別對應一致，分離度良好，陰性溶液在特征峰處無干擾，表明此方法的專屬性好。

A.陰性供試品；B.混合對照品；C.供試品；D.缺黃芩苷陰性對照品；E.缺黃芩素陰性對照品；F.缺漢黃芩素陰性對照品；1.黃芩苷；2.黃芩素；3.漢黃芩素

圖1 芩術痛經(jīng)巴布劑HPLC色譜圖

A.negative sample；B.mixed references；C.sample；D.reference without baicalin；E.reference without baicalein；F.reference without wogonin；1.baicalin；2.baicalein；3.wogonin

Fig.1HPLCchromatogramofQinshudysmenorrheaPapua

2.6線性關系考察 分別精密吸取上述混合對照品儲備液1，2，4，6，8，10 mL，分別置于20 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，按“2.1”項下色譜條件，分別進樣20 μL，記錄色譜圖，以進樣量為橫坐標(X)，以峰面積為縱坐標(Y)，按最小二乘法，進行線性回歸，繪制標準曲線，計算黃芩苷回歸方程為Y=2 147.24X-3 726.83(r=0.999 6)，結果表明黃芩苷進樣量在2.482～24.82 μg含量范圍內線性關系良好；計算黃芩素回歸方程為Y=3 764.36X-4 437.15(r=0.999 5)，結果表明黃芩素進樣量在2.25～22.50 μg含量范圍內線性關系良好；計算漢黃芩素回歸方程為Y=1 759.81X-247.32(r=0.999 6)。結果表明漢黃芩素進樣量在2.206～22.06 μg含量范圍內線性關系良好。

2.7精密度實驗

2.7.1儀器精密度實驗 取上述混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件注入液相色譜儀，各連續(xù)自動進樣20 μL，共6次，記錄色譜圖，黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素峰面積RSD值為0.29%，0.66%和0.91%，表明該方法精密度良好。

2.7.2日內精密度實驗 取自制的芩術痛經(jīng)巴布劑(批號：171220)，除去蓋襯，稱取該制劑約1.5 g(含黃芩生藥量0.40 g)，精密稱定，按照“2.3”項下方法制備，取出6份作為供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，記錄色譜圖，按峰面積計算，分別計算黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素RSD值分別為0.47%，0.98%和0.86%，RSD均小于1%，表明方法日內精密度良好。

2.7.3中間精密度實驗 取自制的芩術痛經(jīng)巴布劑(批號：171220)，除去蓋襯，按照“日內精密度實驗”項下方法，分別配制6份相同濃度的供試品溶液，由兩個不同的分析人員使用Waters e2695型高效液相色譜儀和島津LC-16高效液相色譜儀進行測定，記錄峰面積，分別計算黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素RSD值分別為1.14%，0.71%和1.45，RSD均小于2%，表明方法中間精密度良好。

2.8穩(wěn)定性實驗 取自制的芩術痛經(jīng)巴布劑(批號：171220)，除去蓋襯，稱取該制劑約1.5 g(含黃芩生藥量0.40 g)，精密稱定，按照“2.3”項方法制成供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，于1，2，4，8，12，24 h 分別進樣20 μL，記錄色譜圖，計算黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素峰面積RSD值分別為1.51%，1.78%和0.84%，表明供試品溶液各組分在24 h內穩(wěn)定性良好。

2.9重復性實驗 取自制的芩術痛經(jīng)巴布劑(批號：171220)，除去蓋襯，稱取該制劑約1.5 g(含黃芩生藥量0.40 g)各6份，精密稱定，分別按照“2.3”項下方法制得供試品溶液6份，按“2.1”項下色譜條件分別進行測定，記錄色譜圖，計算各成分平均含量，結果黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素平均含量分別為12.710 88，5.804 24和2.298 91 mg·g-1，計算RSD分別為1.89%，1.34%和1.99%，表明該方法的重復性良好。

2.10加樣回收實驗 稱取已知含量的自制芩術痛經(jīng)巴布劑(批號：171220)6份，每份約0.75 g，精密稱定，分別加入混合對照品適量，按“2.3”項制成供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，分別進樣20 μL，計算回收率。結果黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素平均回收率分別為99.14%，98.90%和99.23%，計算RSD分別為1.50%，1.79%和0.81%，表明該方法測定結果準確可靠。見表1。

表1 黃芩苷、黃芩素及漢黃芩素的加樣回收率考察

Tab.1Studyonrecoveryrateofbaicalin,baicaleinandwogonin

取樣量/g原有量加入量測得量mg回收率/%黃芩苷0.750 216.357 226.355 0012.701 2599.830.750 326.358 156.355 0012.740 28100.430.750 686.361 206.355 0012.642 3998.840.750 476.359 426.355 0012.623 4498.570.750 296.357 906.355 0012.750 03100.580.750 486.359 516.355 0012.498 1396.60黃芩素0.750 212.902 932.902 505.791 5199.520.750 322.903 362.902 505.763 6998.550.750 682.904 752.902 505.826 10100.650.750 472.903 942.902 505.692 1796.060.750 292.903 242.902 505.745 2697.920.750 482.903 982.902 505.825 95100.67漢黃芩素0.750 211.149 781.150 202.287 7498.940.750 321.149 951.150 202.291 6699.260.750 681.150 501.150 202.301 24100.050.750 471.150 181.150 202.278 1398.070.750 291.149 901.150 202.302 45100.200.750 481.150 191.150 202.286 9798.83

2.11樣品含量測定 取的芩術痛經(jīng)巴布劑制劑(批號：171220)，按“2.2.2”項下的供試品溶液制備方法制備，按“2.1”項下的色譜條件進行測定，記錄峰面積，以標準曲線法分別計算黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素的含量依次為12.710，5.805，2.298 mg·g-1。

2.12離體小鼠透皮率測定研究 取SPF小鼠，處死，用8%硫化鈉(自制)脫毛，用剪刀從腹部剝離整個皮膚，用0.9%氯化鈉溶液洗凈[3]。采用改良的Franz擴散池(接收池體積6.5 mL，接收池有效面積2.8 cm2)，將鼠皮背部向下，腹部朝上，固定于接收池上，稱取芩術痛經(jīng)巴布劑約0.5 g，精密稱定(0.500 28 g)，緊貼于小鼠肚皮，接收池內加滿0.9%氯化鈉溶液，設置水浴溫度為(37±1)℃水浴恒溫，開啟磁力攪拌棒以200 r·min-1的速度攪拌，分別于2，4，6，8，10，12 h時，取出接收池中全部接收液，同時取出接收液后立即補充相同體積溫度為(37±1) ℃的新鮮0.9%氯化鈉溶液[4]。

2.12.1芩術痛經(jīng)巴布劑供試品溶液的制備 將分別6次所得接受液分別水浴濃縮至干，殘渣加70%乙醇溶液洗滌至1 mL量瓶中，并定容至刻度，搖勻，過微孔濾膜即得2，4，6，8，10，12 h的離體透皮吸收供試品。

2.12.2離體透皮率含量測定 分別將上述不同時間所得供試品溶液按上述“2.1”項下色譜條件注入高效液相色譜儀，各進樣20 μL，檢測，分別計算供試品中黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素的含量以及經(jīng)皮滲透的動力學擬合。

Cn：第n個時間點的透皮量；∑Ci：第i(i=n-1)個累積透皮量

結果顯示，芩術痛經(jīng)巴布劑的小鼠體外經(jīng)皮滲透行為3個成分均以Higuchi方程擬合為優(yōu)，擬合度為最高，表明芩術痛經(jīng)巴布劑是緩釋制劑，屬于骨架溶蝕型釋藥系統(tǒng)[5]。見表2，3。

表2 黃芩苷、黃芩素及漢黃芩素離體透皮率測定結果

Tab.2Resultsofinvitrotransdermalrateofbaicalin,baicaleinandwogonin

時間/h黃芩苷μg%黃芩素μg%漢黃芩素μg%2518.868.16288.679.94179.9215.654853.3213.42457.1115.74246.1421.4161105.1217.38541.0418.63258.4422.4881257.7219.78574.1519.77262.5822.84101276.8020.08606.6720.89264.5323.01121356.9221.34647.9122.31296.2625.77

3 討論

筆者考察了甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸、甲醇-水、乙腈-水等體系進行梯度洗脫，結果顯示，當流動相采用乙腈-0.1%磷酸時，所測定的成分都達到基線分離，分離效果良好。皮膚角質層類似脂質膜，芩術痛經(jīng)巴布劑中3種成分，主要為黃酮類成分，親脂性較強，通過超臨界提取后，提取率較高，透過皮膚屏障，透過量較高，其中黃芩苷分子量較其他兩個成分較大，極性較高，故其透皮率低于其他兩個成分[6]。緩釋制劑釋藥主要是溶出、擴散及溶蝕與擴散，溶出結合作用。骨架型主要有3種類型：溶蝕性骨架片，不溶性骨架片

表3 黃芩苷、黃芩素及漢黃芩素經(jīng)皮滲透的動力學擬合結果

Tab.3Dynamicfittingresultsofpercutaneousosmosisofbaicalin,baicaleinandwogonin

不同成分與方程速率級數(shù)Q-t方程擬合度透皮速率常數(shù)黃芩苷 零級Q=80.191t+500.1230.93880.191 一級lnQ=96.738t-4 485 280.7270.65596.738 HiguchiQ=409.241t1/2+16.7320.973409.241黃芩素 零級Q=32.543t+291.4590.93532.543 一級lnQ=0.031t+2.4860.8930.0456 HiguchiQ=166.163t1/2+95.0720.971166.163漢黃芩素 零級Q=9.157t+187.2110.8859.157 一級lnQ=0.017t+2.2730.8740.017 HiguchiQ=46.890t1/2+131.6090.92146.890

和親水性凝膠骨架片，釋藥機制各不相同[7-9]。由不可溶解但可溶蝕的蠟質材料制成的溶蝕性骨架片是通過孔道擴散與蝕解控制藥物來釋放。不溶性骨架片的藥物釋放是液體穿透骨架，將藥物溶解然后從骨架的溝槽中擴散出來，故孔道擴散為限速步驟，釋放符合Higuchi方程。