倪曉霞，王慶芬，劉曉玲，葉財(cái)發(fā)

(中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇九醫(yī)院/廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院制劑科，福建 漳州 363000)

復(fù)方黃連灌腸液是按我院消化內(nèi)科協(xié)定處方制成的復(fù)方中藥灌腸液，用于治療潰瘍性結(jié)腸炎，臨床效果顯著。復(fù)方黃連灌腸液處方由黃連、白頭翁、黃芪、甘草、山藥等13味中藥組成，方中多味中藥均含有黃酮類物質(zhì)，本研究擬通過(guò)研究復(fù)方黃連灌腸液中總黃酮含量測(cè)定方法，為建立其質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)。

總黃酮含量測(cè)定常用方法有高效液相色譜法[1]、毛細(xì)管電泳法[2]及紫外可見(jiàn)分光光度法[3-11]等，其中紫外可見(jiàn)分光光度法包括直接測(cè)定法和比色法。近年來(lái)，金屬離子絡(luò)合法[5-11]已成為總黃酮含量測(cè)定應(yīng)用最廣泛的方法[8]，其原理是在酸性或堿性條件下，金屬離子與黃酮發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，生成不同顏色的金屬螯合物，再在紫外或可見(jiàn)光區(qū)用比色法測(cè)定其含量[8]，常用的顯色方法有HCl-Mg法、氯化鋁-醋酸鈉顯色法(AlCl3-CH3COONa法)、硝酸鋁顯色法[NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法]。由于HCl-Mg法反應(yīng)過(guò)程劇烈，反應(yīng)液中含有的乙醇使反應(yīng)結(jié)果的重復(fù)性難以控制，且該法對(duì)多數(shù)異黃酮類成分不顯色[8]，因此本文沒(méi)有采納此法。復(fù)方黃連灌腸液中總黃酮測(cè)定方法未見(jiàn)報(bào)道，筆者分別以槲皮素、蘆丁及橙皮苷為對(duì)照品，對(duì)直接測(cè)定法、AlCl3-CH3COONa法和NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法等3種顯色方法進(jìn)行考察，選擇并優(yōu)化總黃酮含量測(cè)定方法，建立適用于復(fù)方黃連灌腸液中總黃酮含量測(cè)定的方法。

1 儀器與試藥

槲皮素對(duì)照品(批號(hào)：117-39-5)、蘆丁對(duì)照品(批號(hào)：153-18-4)、橙皮苷對(duì)照品(批號(hào)：520-26-3)，均購(gòu)自貴州迪大生物科技有限責(zé)任公司；氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氯化鋁、醋酸鈉(西隴化工股份有限公司)；95%乙醇(上?；瘜W(xué)試劑總廠)；試劑均為分析純；復(fù)方黃連灌腸液(本院自制，批號(hào)：20181206、20181207、20181208)。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備

2.1.1蘆丁對(duì)照品溶液

精密稱取蘆丁對(duì)照品0.031 1 g，加70%乙醇適量，水浴加熱溶解，放置冷卻至室溫，定容至50 ml，搖勻，即得濃度為0.622 mg/ml的對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取儲(chǔ)備液10 ml，用70%乙醇定容至100 ml，搖勻，即得濃度為62.2 μg/ml的對(duì)照品溶液。

2.1.2槲皮素對(duì)照品溶液

精密稱取槲皮素對(duì)照品0.0389g，加70%乙醇適量，溶解并定容至25ml，搖勻，即得濃度為1.556mg/ml的對(duì)照品溶液。

2.1.3橙皮苷對(duì)照品溶液

精密稱取橙皮苷對(duì)照品0.0165g，加70%乙醇適量，水浴加熱溶解，放置冷卻至室溫，定容至25ml，搖勻，即得濃度為0.660mg/ml的對(duì)照品溶液。

根據(jù)以上總結(jié)，同時(shí)結(jié)合安徽新華學(xué)院信息工程學(xué)院的共享資源課程建設(shè)實(shí)際情況，對(duì)資源共享課程建設(shè)從建設(shè)目標(biāo)和具體做法上提出以下建設(shè)方法的探討。

2.2 供試品溶液的制備

精密量取復(fù)方黃連灌腸液2.0 ml，置50 ml容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度搖勻，4 000 r/min，離心15 min，取上清液，即得供試品溶液，備用。

2.3 顯色方法與對(duì)照品考察

2.3.1直接測(cè)定法

精密量取對(duì)照品溶液和供試品溶液(批號(hào)：20181206)1.0 ml置于25 ml容量瓶中，用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻。以60%乙醇為參比，在200～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，記錄光譜圖。結(jié)果蘆丁、槲皮素、橙皮苷對(duì)照品溶液分別在375.9、361.3、285.8nm處有最大吸收；供試品溶液在330.8nm、279.2 nm有強(qiáng)吸收，見(jiàn)圖1A。

2.3.2AlCl3-CH3COONa顯色法

分別精密量取對(duì)照品溶液和供試品溶液(批號(hào)：20181206)1.0 ml置于25 ml容量瓶中，依次加入0.1 mol/L AlCl3溶液3 ml，1 mol/L NaAC溶液4 ml，用60%乙醇稀釋至刻度，以供試液不加顯色劑為參比，在200～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，記錄光譜圖。結(jié)果槲蘆丁、槲皮素、橙皮苷對(duì)照品溶液分別在418.5、436.6、287.2 nm處有最大吸收；供試品溶液在331.8～277.3 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)，吸光度隨波長(zhǎng)變小而增強(qiáng)，在277.3 nm處有最大吸收，見(jiàn)圖1B。

2.3.3NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法

分別精密量取對(duì)照品溶液和供試品溶液(批號(hào)：20181206)1.0 ml置于25 ml容量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液1 ml，搖勻，靜置6 min，繼續(xù)加10%硝酸鋁溶液1 ml，搖勻，靜置6 min，最后加入4%氫氧化鈉溶液10 ml，用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，靜置15 min，以供試液不加顯色劑為參比，在200～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，記錄光譜圖。結(jié)果槲蘆丁、槲皮素、橙皮苷對(duì)照品溶液及供試品溶液均在371.0 nm處有最大吸收，見(jiàn)圖1C。

圖1 顯色方法與對(duì)照品考察圖譜 A.直接測(cè)定法；B.AlCl3-CH3COONa顯色法；C.NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法；1.供試品溶液；2.蘆丁對(duì)照品溶液；3.槲皮素對(duì)照品溶液；4.橙皮苷對(duì)照品溶液

綜合比較以上3種顯色系統(tǒng)，采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色系統(tǒng)時(shí)，3種對(duì)照品溶液的最大吸收波長(zhǎng)均能與供試品溶液的最大吸收波長(zhǎng)一致，max=371 nm。故筆者最終采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法，以蘆丁為對(duì)照品，在371 nm處測(cè)定復(fù)方黃連灌腸液中總黃酮含量，并對(duì)顯色條件進(jìn)行優(yōu)化。

2.4 供試液本體干擾考察

精密量取供試品溶液(批號(hào)：20181206)1.0 ml，置25 ml容量瓶中，加60%乙醇至刻度，以60%乙醇作為參比，于200～800 nm范圍掃描，記錄光譜圖。圖譜顯示在250～400 nm范圍內(nèi)，不加顯色劑的供試品溶液有一定吸收，并且在371 nm波長(zhǎng)附近存在吸收波谷。提示：供試品溶液對(duì)總黃酮含量測(cè)定存在一定的干擾，但選擇371 nm作為總黃酮含量測(cè)定波長(zhǎng)時(shí)，影響最小，故供試品溶液中總黃酮含量測(cè)定以不加顯色劑的供試品溶液作為參比(見(jiàn)圖2)。

2.5 顯色條件優(yōu)化

2.5.1顯色時(shí)間的考察

(1)加入NaNO2后放置時(shí)間對(duì)吸光度的影響：分別精密量取蘆丁對(duì)照品液和供試品溶液1.0 ml置于25 ml容量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液1 ml，搖勻，分別靜置2、4、6、8、10 min，繼續(xù)加10%硝酸鋁溶液1 ml，搖勻靜置6 min，最后加入4%氫氧化鈉溶液10ml，用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻靜置15 min，以供試液不加顯色劑為參比，于371 nm處測(cè)定吸光度。圖譜提示，加入NaNO2后放置時(shí)間對(duì)供試品溶液的吸光度影響不大；加入后6 min時(shí)，蘆丁對(duì)照品溶液有最大吸收，見(jiàn)圖3A。(2)加入Al(NO3)3后放置時(shí)間對(duì)吸光度的影響：分別精密量取蘆丁對(duì)照品溶液和供試品溶液1.0 ml置于25 ml容量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液1 ml，搖勻，靜置6 min，繼續(xù)加10%硝酸鋁溶液1 ml，搖勻，分別靜置2、4、5、6、8、10 min，最后加入4%氫氧化鈉溶液10ml，用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻靜置15 min，以供試液不加顯色劑為參比，于371 nm處測(cè)定吸光度。圖譜提示，加入Al(NO3)3后2～6 min，供試品溶液的吸光度隨放置時(shí)間增大，而后隨時(shí)間延長(zhǎng)，吸光度趨于穩(wěn)定；加入Al(NO3)3后，蘆丁對(duì)照品溶液的吸光度隨放置時(shí)間先增大，5min后開(kāi)始降低，見(jiàn)圖3B。(3)加入NaOH后放置時(shí)間對(duì)吸光度的影響：分別精密量取蘆丁對(duì)照品溶液和供試品溶液1.0 ml置于25 ml容量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液1 ml，搖勻，靜置6 min，繼續(xù)加10%硝酸鋁溶液1 ml，搖勻靜置6 min，最后加入4%氫氧化鈉溶液10ml，用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，分別靜置3、5、10、15、20、25 min，以供試液不加顯色劑為參比，于371 nm處測(cè)定吸光度，記錄結(jié)果。圖譜提示，加入NaOH 10 min時(shí)，供試品溶液與蘆丁對(duì)照品溶液均有最大吸收，見(jiàn)圖3C。

2.5.2顯色劑用量的考察

(1)NaNO2溶液用量對(duì)吸光度的影響：分別精密量取蘆丁對(duì)照品溶液和供試品溶液1.0 ml置于25 ml容量瓶中，分別加5%亞硝酸鈉溶液0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 、2.5、3.0 ml，搖勻，分別靜置6 min，繼續(xù)加10%硝酸鋁溶液1 ml，搖勻靜置6 min，最后加入4%氫氧化鈉溶液10 ml，用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻靜置15 min，以供試液不加顯色劑為參比，于371 nm處測(cè)定吸光度，記錄結(jié)果。圖譜提示，NaNO2溶液用量由0.25 ml增至1.5 ml時(shí)，供試品溶液與蘆丁對(duì)照品溶液吸光度增大，而后隨用量增大吸光度基本趨于穩(wěn)定，見(jiàn)圖4A。(2)Al(NO3)3溶液用量對(duì)吸光度的影響：分別精密量取蘆丁對(duì)照品溶液和供試品溶液1.0 ml置于25 ml容量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液1 ml，搖勻，分別靜置6 min，分別繼續(xù)加10%硝酸鋁溶液0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml，搖勻靜置6 min，最后加入4%氫氧化鈉溶液10ml，用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻靜置15 min，分別以供試液不加顯色劑為參比，于371 nm處測(cè)定吸光度，記錄結(jié)果。圖譜提示，Al(NO3)3溶液用量為0.5～1.5ml，蘆丁對(duì)照品溶液吸光度趨于穩(wěn)定，而后隨用量增大而降低；Al(NO3)3溶液用量為0.5～1.0 ml，供試品溶液吸光度趨于穩(wěn)定，而后隨用量增大而降低，見(jiàn)圖4B。(3)NaOH溶液用量對(duì)吸光度的影響：分別精密量取蘆丁對(duì)照品溶液和供試品溶液1.0 ml置于25 ml容量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液1 ml，搖勻，分別靜置6 min，繼續(xù)加10%硝酸鋁溶液1 ml，搖勻靜置6 min，最后加入4%氫氧化鈉溶液3、5、7.5、10、12.5、15ml，用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻靜置15 min，分別以供試液不加顯色劑為參比，于371 nm處測(cè)定吸光度，記錄結(jié)果。圖譜提示，NaOH溶液用量為7.5 ml，蘆丁對(duì)照品溶液吸光度最大，而后隨用量增大而降低；NaOH溶液用量為5～10ml，供試品溶液吸光度趨于穩(wěn)定，而后隨用量增大而降低，見(jiàn)圖4C。

圖3 顯色時(shí)間考察圖譜 A.加入NaNO2后放置時(shí)間對(duì)吸光度的影響；B.加入Al(NO3) 3后放置時(shí)間對(duì)吸光度的影響；C.加入NaOH后放置時(shí)間對(duì)吸光度的影響；a.供試品溶液；b.蘆丁對(duì)照品溶液

圖4 顯色劑用量考察圖譜 A.NaNO2溶液用量對(duì)吸光度的影響；B.Al(NO3) 3溶液用量對(duì)吸光度的影響；C.NaOH溶液用量對(duì)吸光度的影響；a.供試品溶液；b.蘆丁對(duì)照品溶液

2.5.3顯色條件確定

結(jié)合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，綜合考慮實(shí)驗(yàn)過(guò)程的高效性與經(jīng)濟(jì)效益，最終確定NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色體系的條件為加5%亞硝酸鈉溶液1.5ml，搖勻，分別靜置6 min，繼續(xù)加10%硝酸鋁溶液1 ml，搖勻靜置5 min，最后加入4%氫氧化鈉溶液7.5ml，用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻靜置10 min，以供試液不加顯色劑為參比，于371 nm處測(cè)定吸光度。

2.6 提取溶劑濃度考察

精密量取供試液(20181206)5.0ml，分別用水及30%、50%、60%、70%、80%乙醇溶液和無(wú)水乙醇定容至50ml，4 000 r/min，離心15min，取上清液備用。分別精密量取上述各上清液1.0ml，按“2.5.3”項(xiàng)下顯色條件，于371nm處測(cè)定吸光度，記錄結(jié)果。圖譜提示，當(dāng)提取溶劑中乙醇濃度為70%時(shí)，供試品溶液有最大吸光度(見(jiàn)圖4C)。

圖5 提取溶劑乙醇濃度對(duì)吸光度的影響

2.7 方法學(xué)考察

2.7.1線性與回歸方程

精密量取蘆丁對(duì)照溶液(62.2 μg/ml)1、2、2.5、3、4、5 ml，分別置于25 ml量瓶中，按“2.5.3”項(xiàng)下顯色條件，制備系列濃度對(duì)照品溶液，以同法制備參比溶液，于371 nm處測(cè)定吸光度，以濃度(g/L)為橫坐標(biāo)、吸光度(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算得回歸方程為：Y=7.63551X-0.02706 (r=0.9995)，表明蘆丁對(duì)照品濃度在2.488～12.44 μg/ml范圍內(nèi)與吸光度之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.7.2精密度試驗(yàn)

精密量取蘆丁對(duì)照溶液1.0 ml，6份，置于25 ml量瓶中，按“2.5.3”項(xiàng)下顯色條件于371 nm處測(cè)定吸光度，以吸光度計(jì)算RSD%(n=6)，結(jié)果RSD為0.77 %，表明儀器的精密度良好。

2.7.3重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批復(fù)方黃連灌腸液(批號(hào)：20181212)6份，按“2.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液，精密量取供試品溶液1.0 ml，按“2.5.3”項(xiàng)下顯色條件，于371 nm測(cè)定吸光度并計(jì)算總黃酮含量。結(jié)果供試品溶液總黃酮的平均含量為15.41 mg/ml，RSD為0.32 %，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7.4加樣回收率試驗(yàn)

精密量取供試品溶液(批號(hào)：20181212，總黃酮含量為0.308 8 mg/ml)0.5 ml置于25 ml容量瓶中，分別加入蘆丁對(duì)照品溶液(0.622 mg/ml)0.25 ml，按“2.5.3”項(xiàng)下顯色條件，于371 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度并計(jì)算總黃酮含量。結(jié)果得平均回收率為100.43%，RSD為1.328%(n=6)，見(jiàn)表1。

2.8 復(fù)方黃連灌腸液總黃酮含量測(cè)定

取復(fù)方黃連灌腸液按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液3批(批號(hào)：20181206、20181207、20181212)，分別精密量取供試品溶液0.5 ml，按“2.5.3”項(xiàng)下顯色條件，依次添加各試劑，于371 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度并計(jì)算總黃酮含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 復(fù)方黃連灌腸液總黃酮含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

黃酮類化合物是一類重要的天然有機(jī)化合物，泛指具有2-苯基色原酮結(jié)構(gòu)的化合物，來(lái)源不同的黃酮類物質(zhì)母核上結(jié)合的不同的機(jī)能基團(tuán)，包括酚羥基、各種糖苷等，因此其數(shù)量列為天然酚類化合物之首[12]。黃酮類化合物的特殊母核結(jié)構(gòu)存在兩個(gè)主要的紫外吸收帶：峰帶I(300～400 nm)和峰帶II(220～280 nm) ，但一般藥材或飲片提取物中存在多種干擾物質(zhì)，對(duì)其含量測(cè)定產(chǎn)生較大干擾。NaNO2-Al( NO3)3-NaOH顯色法的原理是在堿性條件下，黃酮類化合物中的3-OH、4-OH、5-OH、4-CO或鄰二位酚羥基等與Al3+進(jìn)行絡(luò)合反應(yīng)，生成紅色絡(luò)合物，并且一定濃度范圍內(nèi)，其濃度與吸光度符合比爾定律。

目前，已有文獻(xiàn)報(bào)道采用NaNO2-Al( NO3)3-NaOH顯色法測(cè)定總黃酮含量[4-12]，而該方法用于復(fù)方黃連灌腸液中總黃酮含量測(cè)定尚未見(jiàn)報(bào)道，故筆者參考該顯色法用于測(cè)量黃連灌腸液中總黃酮含量，并對(duì)該具體顯色時(shí)間和顯色劑用量進(jìn)行考察，最終確定1.5 ml 5% NaNO2溶液(6 min)、1.0 ml 10% Al( NO3)3溶液(5 min)和7.5 ml 4% NaOH溶液(10 min)為最佳顯色條件。通過(guò)對(duì)該方法進(jìn)行精密度、重復(fù)性及加樣回收率等方面考察，結(jié)果表明，該方法適用于復(fù)方黃連灌腸液中總黃酮含量測(cè)定，具有簡(jiǎn)便快速、準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點(diǎn)。

文中測(cè)定的3批復(fù)方黃連灌腸液中總黃酮含量波動(dòng)從11%到15%，含量相差較大，其原因可能與第三批制劑(批號(hào)為20181212)啟用新一批次原料藥材有關(guān)，由于中藥飲品質(zhì)量良莠不齊，可能造成不同批次制劑成品之間總黃酮含量相差較大，建議加強(qiáng)該制劑相關(guān)原料藥材的質(zhì)量控制；結(jié)合制劑提取、澄清工藝考察結(jié)果與原料藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)范圍，進(jìn)行復(fù)方黃連灌腸液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，合理設(shè)置復(fù)方黃連灌腸液中總黃酮含量的限度值，以保證臨床用藥安全有效。