張娟娟，于 海，吳志宏，徐 順，張立超

(1.上海市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，上海 200071;2.上海市浦東新區(qū)新場社區(qū)衛(wèi)生服務中心，上海 201314；3.上海市第七人民醫(yī)院燒傷整形科，上海200137)

醋酸曲安奈德(triamcinolone acetonide acetate cream，TAC)等激素是局部治療病理性瘢痕的一線藥物，但是致密的角質層阻礙其有效透過皮膚，而采用病灶內(nèi)注射給藥，已成為基礎療法之一[1]。但該方法存在需多點注射、所造成的疼痛感強烈、藥物分布不均、注射點藥物濃集易致局灶性皮膚萎縮或壞死等不足，限制了在大面積燒傷瘢痕中的應用[1-2]。

微針促透技術已逐步走向成熟，越來越多蛋白質、疫苗等大分子藥物的微針經(jīng)皮給藥已被FDA批準用于臨床。數(shù)百個微針刺破角質層瞬間形成孔道，藥物沿著孔道進入皮膚深層，具有無痛微創(chuàng)、促透均勻、操作簡便等特點。但是其給藥面積小，仍然不適合大面積瘢痕給藥。為此，我們前期引入美容業(yè)使用多年的滾輪微針用于增生性瘢痕(HS)的經(jīng)皮促透，并證實TAC的微針促透效率僅次于注射給藥，藥物分布相對均勻、無痛且操作方便[2-4]。本文采用移植的人HSc裸鼠模型，以TAC的抗瘢痕療效為標準，驗證微創(chuàng)滾輪微針對TAC涂布給藥抗瘢痕效果的改善作用。

1 材料與方法

1.1 動物、主要試劑和儀器

4～6周齡BALB/c-nu/nu裸鼠，單純T淋巴細胞缺陷品系，雌雄不拘，體質量18～20 g，由第二軍醫(yī)大學動物中心提供。

TAC乳膏(質量分數(shù)0.1%，每支4 g，批號120602)和TAC注射液(5ml:50 mg，批號130106)購自上海通用藥業(yè)股份有限公司；Masson三色染色試劑盒(福州邁新生物技術開發(fā)有限公司)；兔抗人α-SMA單克隆抗體、兔抗人CD34抗體(英國Abcam公司)；原位末端標記(TUNEL)試劑盒(美國Trevigen公司)；EnVision試劑即用型(丹麥Dako公司)；滾輪微針(192針，針長500 μm，美國Clinical Resolution Laboratory)；ASP300S型全自動組織脫水機(德國徠卡公司)；CHC-212型光學顯微鏡(日本Olympus公司)；80i顯微成像系統(tǒng)(日本尼康公司)；自粘性透明貼膜(英國Smithnephy公司)。

1.2 人HS組織的制備

HS組織取自21例在上海市第七人民醫(yī)院燒傷整形科行早期整形修復的燒傷后HS患者，患者術前均知情同意。待移植的HS肉面組織被修剪，制成厚約0.3 cm、大小2.0 cm×2.0 cm的HS皮片，滅菌生理鹽水紗布包裹，3 h內(nèi)完成移植。同時切取部分組織行病理學檢查，驗證HS的形態(tài)學特點。

1.3 人HS移植裸鼠模型的制作與驗證

1.3.1模型制作

取裸鼠采用35 g/L水合氯醛按0.1 ml/10 g腹腔注射麻醉。將裸鼠俯臥位固定于無菌操作臺上，背部用碘伏消毒兩遍，龍膽紫畫出2.0 cm×2.0 cm手術切口線，切開皮膚全層至深筋膜淺面，沿此層剪除全層皮膚。將預先制備的HS皮片移植到創(chuàng)面上，5/0絲線間斷縫合，打包包扎，3 h內(nèi)完成移植。術后5 d拆包，10 d拆線，見圖1。

圖1 人HS移植裸鼠模型的建立 a.修剪后的人HSc組織(2 cm×2 cm×0.3 cm)移植于裸鼠背部；b.打包固定；c.術后10 d拆線，可見移植的HS與周圍的皮膚愈合良好，色澤轉紅；d.拆線25 d后，移植的HS增生，表面粗糙，高出周圍皮膚，色紅，輕度攣縮

1.3.2模型驗證

術后觀察并記錄移植HS的大體形態(tài)，記錄HS組織恢復至移植前的大體形態(tài)所需時間。90 d后將模型裸鼠拉頸處死，測量HS高出切取移植的HS組織裸鼠正常皮膚的高度。將HS組織常規(guī)固定、石蠟包埋、切片(厚4 μm)，行HE染色和Masson染色，光鏡下觀察HS的組織學特點，且與移植前HS組織和建模裸鼠的皮膚對比，以證實模型的可靠性。

1.4 滾輪微針對TAC乳膏抗瘢痕作用的影響

1.4.1分組處理及標本采集

取72只成功建立人HS移植模型的裸鼠，按照隨機數(shù)字表法分為以下3組，每組24只，并行相應處理60 d。①單純?nèi)楦嘟M，HS涂TAC乳膏0.2 mg/cm2，自粘性透明貼膜密封固定，每日涂藥1次。②微針+乳膏組，每日1次用500 μm滾輪微針在移植的HS上垂直交叉滾動各2個來回，其余處理同單純?nèi)楦嘟M。③注射液組，HS內(nèi)注射TAC注射液0.2 mg/cm2，每周1次。給藥期間觀察各組裸鼠大體形態(tài)學變化。給藥15、30、45、60 d每組隨機處死6只裸鼠，取移植的HS組織行組織病理學觀察和免疫組織化學檢測。

1.4.2組織病理學觀察

常規(guī)石蠟包埋切片后行HE染色，于光學顯微鏡下觀察HS組織病理學變化。

1.4.3免疫組織化學檢測

采用生物素-鏈霉親和素-過氧化物辣根酶染色(ELPS)法檢測HS組織中CD34或α肌動蛋白(α-SMA)陽性表達細胞。切片經(jīng)1∶10兔血清封閉非特異性抗原后，按照試劑盒說明書行免疫組織化學染色，兔抗人CD34或α-SMA的抗體稀釋比為1∶200。透明封片后行半定量圖像分析。

1.4.4細胞凋亡檢測

采用TUNEL法檢測HS組織中細胞凋亡情況。切片染色操作按照試劑盒說明書進行，1∶100稀釋生物素化抗地高辛抗體，DAB顯色。對染色切片行半定量圖像分析。

半定量圖像分析。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)，由2名病理醫(yī)師雙盲觀測3個具有代表性的200倍視野(TUNEL為400倍視野)，圖像信息攝入圖像分析系統(tǒng)，經(jīng)過增強、去噪、分割、灰度轉換、圖像識別及分析等步驟，由系統(tǒng)測量出CD34、α-SMA或TUNEL法陽性染色的細胞數(shù)目、平均光密度、微血管記數(shù)，進行半定量分析，評定藥效學。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 移植的人HS裸鼠模型的組織形態(tài)學特征

2.1.1大體形態(tài)特點

12只裸鼠移植了人HS組織，術后10 d拆線可見移植的HS與周圍的皮膚愈合良好，色澤轉紅，表皮菲薄，質地較軟。隨后10 d左右，部分表皮逐漸變黃、變黑并形成干痂。伴隨干痂脫落，移植的HS從邊緣到中央、從深層到淺層逐漸變硬，色紅，表面粗糙，高出周圍皮膚(圖1)。其中10只的HSc組織恢復至移植前的大體形態(tài)，需時(34.504.06)d。術后90 d測量，移植的HS已高出裸鼠正常皮膚平均(1.830.49)mm。

2.1.2組織病理學特點

術后90 d移植的HS組織真皮層明顯增厚，真皮乳頭層和網(wǎng)狀層界限不清，膠原呈漩渦狀或結節(jié)狀分布，微血管增多，并可見到細胞核分裂相，與移植前的HS組織特點相似，見圖2a、2b；HS周圍的皮膚層次分明，可見大量皮膚附件，膠原排列規(guī)則，細胞成分以及血管數(shù)量較少，見圖2c。Masson染色可見移植后HS組織膠原致密，排列紊亂，見圖2d。

圖2 人HS移植裸鼠模型的HE染色結果 HE×200 a.移植前人HS組織Fb增生明顯，膠原密集、排列紊亂，無汗腺、毛囊和皮脂腺；b.術后90 d裸鼠背部的移植人HS組織，組織特征與移植前人HS相似；c.移植HS周圍的裸鼠皮膚，表皮層和真皮層薄，組織結構疏松有序，可見汗腺、皮脂腺和毛囊結構；d.移植瘢痕組織，膠原束排列紊亂，膠原纖維致密

2.2 滾輪微針對TAC乳膏抗瘢痕作用的影響

2.2.1裸鼠大體形態(tài)學變化

給藥60 d，注射液組和微針+乳膏組的移植HS表面變平、色淡、質地變?nèi)彳?；單純?nèi)楦嘟M的HS多數(shù)高出周圍皮膚，表面凹凸不平，充血明顯，質硬(圖3)。

2.2.2移植的HS組織中CD34陽性細胞表達和微血管數(shù)目

高給藥30、45和60 d，微針+乳膏組和注射液組的CD34陽性細胞表達，主要定位在微血管內(nèi)皮細胞的胞漿中，呈棕黃色或棕褐色。CD34陽性表達的血管數(shù)目均顯著低于單純?nèi)楦嘟M(P<0.05)。微針+乳膏組與注射液組比較，30 d陽性表達血管數(shù)目顯著較多(P<0.05)，45 d和60 d后無顯著差異(見表1)。

2.2.3移植的HS組織中α-SMA陽性細胞表達

半定量圖像分析結果顯示，各組的HS組織中肌成纖維細胞和新生小血管均有α-SMA陽性表達，呈深棕色或棕黃色。注射液組15 d以后各時段α-SMA陽性表達均較單純?nèi)楦嘟M顯著減少(P<0.05)。微針+乳膏組在給藥30 d以后的時段比單純?nèi)楦嘟M陽性表達顯著減少(P<0.05)，見表2。

2.2.4移植HS組織中細胞凋亡情況

注射液組各時段的細胞凋亡數(shù)目均高于單純?nèi)楦嘟M(P<0.05)，僅45 d顯著高于微針+乳膏組(P<0.05)。微針+乳膏組在給藥30、45、60 d細胞凋亡數(shù)高于單純?nèi)楦嘟M(P<0.05)，見表3。

圖3 裸鼠給藥期間移植HS的大體變化 a.單純?nèi)楦嘟M；b.微針+乳膏組；c.注射液組；a1～a4、b1～b4、c1～c4分別為給藥15、30、45、60 d。a4單純?nèi)楦嘟M給藥60 d，瘢痕仍高出皮面，質硬，攣縮；b2和c2示微針+乳膏組和注射液組給藥30 d，瘢痕開始縮小，b4和c4示給藥60 d瘢痕明顯變平、縮小

組別鼠數(shù)(只)給藥15d給藥30d給藥45d給藥60d乳膏組620.33±1.9719.33±1.1317.17±1.6015.83±1.84微針+乳膏組619.00±0.7515.17±0.75*10.31±0.89*7.83±0.75*注射液組618.33±1.0712.13±1.23*,#10.67±1.06*9.87±1.96*F1值(P1值)159.085(0.001)F2值(P2值)156.50(0.001)F3值(P3值)13.317(0.001)

注：F1、P1值為不同時段多重比較；F2、P2值為不同組間多重比較，F(xiàn)3值、P3值為不同給藥方式與各檢測時段間的交互效應；*P<0.05，與乳膏組比較；#P<0.05，與微針組比較

表2 不同給藥組HS組織內(nèi)α-SMA陽性細胞表達比較(200倍視野，

注：F1、P1值為不同時段多重比較；F2、P2值為不同組間多重比較，F(xiàn)3值、P3值為不同給藥方式與各檢測時段間的交互效應；*P<0.05，與單純?nèi)楦嘟M比較；#P<0.05，與微針+乳膏組比較

表3 不同給藥組HS組織內(nèi)細胞凋亡數(shù)比較(400倍視野，

注：F1、P1值為不同時段多重比較；F2、P2值為不同組間多重比較，F(xiàn)3值、P3值為不同給藥方式與各檢測時段間的交互效應；aP<0.05,與乳膏組比較；bP<0.05,與微針組比較

3 討論

TAC通過抑制成纖維細胞(Fb)增殖，促進其成熟或凋亡，阻止其向肌成纖維細胞轉化；抑制血管內(nèi)皮細胞增殖和遷移，減少新生血管形成，使瘢痕組織內(nèi)的營養(yǎng)物質和氧運輸減少；降低膠原、纖維黏連蛋白、蛋白多糖等細胞外基質(ECM)的合成，促使膠原降解或向成熟膠原轉化等機制抑制瘢痕增生，是公認的抗瘢痕標準藥物，但注射給藥的弊端限制其在大面積燒傷瘢痕中的應用[1,5-6]。

微針由單晶硅、不銹鋼等材料制成，數(shù)百微米長、數(shù)百微針/cm2貼片組成陣列，通過短暫、可逆地破壞角質層形成數(shù)百個孔道，實現(xiàn)高效促透。胰島素微針透皮，療效與皮下注射相當[7]。此外，由于皮膚的彈性阻力，針長500 μm的微針并未完全刺入皮膚。我們前期采用石蠟切片、HE染色法考察針長500 μm的微針，使用力度2.5～20.0 N，微針孔深度僅為60～110 μm，相當于進入表皮，并未觸及真皮神經(jīng)和血管，因此無痛、不出血[4]。這與文獻[8]報道一致。我們認為，微針高效促透、無痛、操作方便等特性，恰巧可避免瘢痕內(nèi)注射給藥的諸多不足。

國內(nèi)外微針研究集中于實現(xiàn)自身無法透皮的蛋白質或多肽、疫苗、DNA等藥物的促透給藥[3,8]。國內(nèi)已有蔡景龍課題組采用全身麻醉下將滾輪微針刺入真皮層，導入TAC治療HS的臨床報道，但該法是疼痛和有創(chuàng)的，不利于臨床推廣應用[8]。

近年我們系統(tǒng)考察了滾輪微針在僅穿透角質層的情況下，TAC在離體和在體HS中的促透特性和皮膚刺激性[2-4]。HPLC法結果表明微針+乳膏組顯示了與注射液組不同的藥物釋放特性。注射液組藥物進入皮膚后滯留量快速下降且分布不均勻，而微針+乳膏組則相對緩慢持久且分布均勻，12 h 后藥物透過量達到涂布藥量的60.64%，組織中TAC滯留量高出直接涂布4.18倍。激光多普勒血流量法顯示注射液組的皮膚刺激性高于微針+乳膏組8.40倍。因此，本課題進一步采用人移植HS裸鼠模型，采用TAC作為抗瘢痕治療的標準藥物，模擬臨床給藥量進行了療效觀察，驗證僅穿透角質層的滾輪微針用于抗瘢痕藥物促透給藥的療效。

本課題采用的人HS移植裸鼠模型，制作成功率較高(83%)，平均需時34.5 d，90 d后仍可見移植的HS組織中Fb增生明顯，膠原密集堆積、排列紊亂，無汗腺、毛囊和皮脂腺，較好地保持移植前的組織形態(tài)學特征，適用于瘢痕防治的研究。建模過程中，我們觀察到術后10 d移植的人HS質地柔軟且色澤紅潤，建立了血供。但隨后的15 d左右，表皮逐漸出現(xiàn)變黃、變黑并形成薄層干痂，隨著干痂脫落，移植的HS組織恢復了原有的大體形態(tài)特征，提示移植的HS表層細胞經(jīng)歷了一次壞死和更新的過程，推測與瘢痕基底膠原致密、早期血供相對不足有關。亦不排除瘢痕淺層細胞成分多、抗原性較強，出現(xiàn)類似于人全厚皮膚移植給裸鼠時的排斥反應[10]。

本研究結果顯示單純?nèi)楦嘟M整個過程均未能觀察到對HS的作用效應，提示TAC受到角質層阻擋，HS組織中未能達到效應濃度，與我們的前期研究結果[2-4]呼應。而微針+乳膏組可見移植的HS縮小、變平、變軟，色澤變淡，用藥30 d其CD34和α-SMA表達減少，細胞凋亡數(shù)增加，用藥45、60 d各項指標均達到注射液組水平，提示微針使組織中TAC達到的濃度對瘢痕增生產(chǎn)生了顯著的抑制作用，有效地強化了涂布給藥的效果。盡管微創(chuàng)、無痛地使用滾輪微針導入TAC的方法，起效時間稍遲，但療效與注射液組相當，為臨床合理應用滾輪微針治療HS提供了依據(jù)。