孟 慧，許 勇

(中國人民解放軍海軍905醫(yī)院設(shè)備科，上海，200052)

以抗生素為代表的微生物天然產(chǎn)物因具有重要生物活性一直是人類治療疾病的主要藥物，如抗感染藥物青霉素(penicillin)和紅霉素(erythromycin)、抗腫瘤藥物博來霉素(bleomycin)和埃博霉素(epothilone)、抗寄生蟲藥物阿維菌素(avemectin)和免疫抑制劑環(huán)孢素(cyclosporin)等[1]。迄今，僅從微生物的次生代謝產(chǎn)物中就發(fā)現(xiàn)了16000余種活性物質(zhì)和數(shù)萬種衍生物和結(jié)構(gòu)修飾物，先后推向臨床的微生物藥物約有200余種。海洋特殊的生存環(huán)境，如高鹽、高壓、低溫和寡營養(yǎng)，使生活在其中的微生物具備特殊的遺傳物質(zhì)，在長期進(jìn)化過程中獲得產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎次級代謝產(chǎn)物的能力，因此，海洋微生物被看作是下一代新藥研發(fā)的藍(lán)色寶庫[2-3]。近年來，從我國近海的海洋微生物中發(fā)現(xiàn)了大量活性顯著、結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn)物，成為藥物研發(fā)領(lǐng)域的新熱點[4-5]。

鑒于海洋微生物產(chǎn)生新穎天然產(chǎn)物的巨大潛力，本研究對來源于海洋近海的海洋真菌開展次級代謝產(chǎn)物研究，運用正、反相硅膠柱色譜、凝膠柱色譜以及高效液相色譜(HPLC)等分離純化技術(shù)，對分離自海南三亞附近海域的共附生真菌Chaetomiumsp.進(jìn)行次級代謝產(chǎn)物的研究。毛殼屬(Chaetomium)是腐生子囊菌中數(shù)量最多的類群之一，至今共鑒定了81種，是一類重要的資源真菌，呈世界性分布[6]。Ahmed課題組在對爵床科鴨嘴花(JusticiaadhatodaL.)的內(nèi)生真菌研究中發(fā)現(xiàn)Chaetomiumsp.NF15的提取物對金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和白色念珠菌(Candidaalbicans)都有顯著的抗菌活性[7]。譚仁祥課題組從沙參(Adenophoraaxilliflora)的內(nèi)生真菌Chaetomiumsp.IFB-E015.中分離得到新穎的生物堿chaetominine，其對白血病K562細(xì)胞和結(jié)腸癌SW116細(xì)胞具有強力的細(xì)胞毒活性[8]。本研究從Chaetomiumsp.中分離純化得到4個十元環(huán)內(nèi)酯類化合物(nonanolide)和1個倍半萜類化合物，并運用質(zhì)譜、核磁共振等現(xiàn)代波譜技術(shù)結(jié)合文獻(xiàn)報道完成了結(jié)構(gòu)鑒定(見圖1)。

圖1 從Chaetomium sp.中分離鑒定的5個化合物結(jié)構(gòu)式

1 儀器、試劑與材料

1.1 儀器與試劑

HZQ-F280型全溫震蕩培養(yǎng)箱(中國，常州金壇精達(dá)儀器制造有限公司)；LDZH-200KBS型立式壓力蒸汽滅菌器(中國，上海申安醫(yī)療器械有限公司)；Bruker Varian Inova-600、Avance-500核磁共振儀(德國，Bruker公司)；Agilent 1100高效液相色譜儀配有RID檢測器(美國，Agilent公司)和Zorbax 300-C18柱(250 mm × 9.4 mm，5 μm，美國，Agilent公司)；Sephadex LH-20凝膠(美國，Amersham Pharmacia Biotech公司)；TLC薄層板、柱色譜(中國，煙臺黃務(wù)硅膠開發(fā)實驗廠)；開放柱色譜所用溶劑甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、石油醚和丙酮均為分析純(中國，國藥集團上?；瘜W(xué)試劑公司)，HPLC所用試劑為色譜純甲醇(中國，上海阿達(dá)瑪斯有限公司)和水(中國，娃哈哈集團有限公司)。

1.2 樣品

實驗所用菌株由本實驗室從海南三亞沿海的海底沉積物中分離得到，并鑒定為Chaetomiumsp.，菌株編號HN1186。將菌株接種到培養(yǎng)基上(50 g生物麥芽糖，15 g瓊脂，800 ml人工海水，pH 7.4)，培養(yǎng)箱溫度28℃，固體培養(yǎng)30 d，共培養(yǎng)480塊。

2 提取與分離

共附生真菌Chaetomiumsp.(編號HN1186)菌株用含5%生物麥芽提取物的Biomalt固體瓊脂培養(yǎng)基室溫發(fā)酵30 d，培養(yǎng)物用乙酸乙酯提取(3.0 L×5次)，合并提取液，濃縮得總浸膏2.50 g。將總浸膏進(jìn)行正相硅膠柱色譜分離，依次用石油醚/丙酮(100∶0,50∶1,20∶1,10∶1,5∶1,4∶1,3∶1,2∶1,1∶1,0∶1)和甲醇系統(tǒng)作為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，TLC點板合并得到Fr.A～ K共11個部分。對Fr.E進(jìn)行Sephadex LH-20凝膠柱色譜[CH2Cl2∶MeOH=(2∶1)]，TLC點板合并得到Fr.E1～ E9共9個組分，對Fr.E5進(jìn)行ODS柱色譜分離(20%～100%甲醇/水)和半制備HPLC(40%甲醇/水，2.0 ml/min)純化，得到單體化合物2 (4.0 mg)和5 (3.2 mg)。對Fr.E7進(jìn)行半制備HPLC(35%甲醇/水，2.0 ml/min)純化，得到單體化合物1 (1.8 mg)。對Fr.H進(jìn)行Sephadex LH-20凝膠柱色譜(CH2Cl2：MeOH=2:1)，TLC點板合并得到Fr.H1～ H7共7個組分，對Fr.H2進(jìn)行半制備HPLC(25%甲醇/水，2.0 ml/min)純化，得到單體化合物3 (1.5 mg)和4 (1.8 mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

所有化合物進(jìn)行MS譜和1H、13C NMR譜的波譜數(shù)據(jù)采集，經(jīng)過波譜解析和與參考文獻(xiàn)比對，完成了結(jié)構(gòu)鑒定。

化合物1：ESI-MS：m/z [M+H]+215.08， 分子式為C10H14O5。1H-NMR(400 MHz，CDCl3)δH：2.88(1H，dd，J=14.5，6.8，H-2a)，2.41(1H，dd，J=14.5，10.0 Hz，H-2b)，3.51(1H，dd，J=14.5，10.0 Hz，H-3)，2.80(1H，dd，J=7.0，1.7 Hz，H-4)，2.63(1H，dd，J=8.2，1.8 Hz，H-5)，2.56(1H，dd，J=8.2，4.4 Hz，H-6)，3.02(1H，dt，J=8.2，4.0 Hz，H-7)，2.25(1H，dd，J=14.9，4.8 Hz，H-8a)，1.70(1H，dd，J=14.9，4.1 Hz，H-8b)，4.89(1H，m，H-9)，1.30(3H，d，J=6.4 Hz，H-9Me)。13C-NMR(100 MHz，CDCl3)δC：172.6(C-1)，44.0(C-2)，72.6(C-3)，60.2(C-4)，60.5(C-5)，58.9(C-6)，55.2(C-7)，38.8(C-8)，73.1(C-9)，23.9(C-9Me)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]的botryolide A基本一致。

化合物2：ESI-MS：m/z [M+H]+199.09，分子式為C10H14O4。1H-NMR(400 MHz，CDCl3)δH：2.67(1H,dd，J=10.3，3.6 Hz，H-2a)，2.44(1H，dd，J=10.5，10.0 Hz，H-2b)，4.89(1H，m，H-3)，5.72(1H，ddd，J=11.5，8.1，1.8 Hz，H-4)，5.47(1H，ddd，J=11.5，5.4，1.0 Hz，H-5)，3.48(1H，m，H-6)，3.00(1H，m，H-7)，2.18(1H，m，H-8a)，1.25(1H，m，H-8b)，5.30(1H，m，H-9)，1.29(3H，d，J=6.2 Hz，H-9Me)。13C-NMR(100 MHz，CDCl3)δC：170.2(C-1)，43.7(C-2)，67.9(C-3)，128.1(C-4)，135.9(C-5)，57.2(C-6)，53.5(C-7)，38.2(C-8)，67.9(C-9)，20.6(C-9Me)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]的botryolide B基本一致。

化合物3：ESI-MS： m/z [M+H]+217.10，分子式為C10H16O5。1H-NMR(400 MHz，CDCl3)δH：2.67(1H，dd，J=16.4，2.4，H-2a)，2.28(1H，m，H-2b)，4.12(1H，m，H-3)，2.42(1H，m，H-4a)，1.46(1H，m，H-4b)，2.46(1H，m，H-5a)，2.25(1H，m，H-5b)，4.12(1H，m，H-7)，2.29(1H，m，H-8a)，1.94(1H，m，H-8b)，4.99(1H，m，H-9)，1.20(3H，d，J=6.4Hz，H-9Me)。13C-NMR(100 MHz，CDCl3)δC：170.3(C-1)，42.5(C-2)，64.1(C-3)，30.9(C-4)，35.1(C-5)，211.0(C-6)，74.4(C-7)，39.5(C-8)，69.2(C-9)，19.8(C-9Me)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]的botryolide D基本一致。

化合物4：ESI-MS：m/z [M+H]+199.06，分子式為C10H14O4。1H-NMR(400 MHz，CDCl3)δH：2.58(2H，m，H-2)，4.99(1H，m，H-3)，5.86(1H，d，J=6.1 Hz，H-4)，5.76(1H，d，J=6.1 Hz，H-5)，4.85(1H，s，H-6)，3.75(1H，m，H-7)，1.82(1H，m，H-8a)，1.57(1H，m，H-8b)，4.95(1H，m，H-9)，1.17(3H，d，J=6.4 Hz，H-9Me)。13C-NMR(100 MHz，CDCl3)δC：171.3(C-1)，39.5(C-2)，81.2(C-3)，127.3(C-4)，131.3(C-5)，92.2(C-6)，72.9(C-7)，41.9(C-8)，71.0(C-9)，21.3(C-9Me)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]的decarestrictine I基本一致。

化合物5：ESI-MS：m/z [M+H]+265.14，分子式為C15H20O4。1H-NMR(400 MHz，CDCl3)δH：3.91(1H，d，J=14.5 Hz，H-2)，2.01(1H，ddd，J=13.6,5.6,1.8 Hz，H-3a)，2.68(1H，dd，J=14.0,4.0 Hz，H-3b)，4.30(1H，brs，H-4)，2.88(1H，d，J=9.2 Hz，H-7a)，2.28(1H，d，J=9.2 Hz，H-7b)，6.45(1H，d，J=5.7 Hz，H-10)，3.81(1H，J=5.7 Hz，H-11)，3.02(1H，d，J=8.1 Hz，H-13a)，2.83(1H，d，J=8.1 Hz，H-13b)，0.79 (3H，s，H-14)，0.97 (3H，s，H-15)，1.81 (3H，s，H-16)。13C-NMR(100 MHz，CDCl3)δC：79.3(C-2)，40.3(C-3)，73.3(C-4)，49.3(C-5)，43.3(C-6)，42.2(C-7)，198.9(C-8)，138.3(C-9)，137.4(C-10)，69.9(C-11)，65.7(C-12)，47.3(C-13)，6.0(C-14)，18.4(C-15)，15.5(C-16)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]的trichothecolone基本一致。

4 討論

筆者對海洋真菌Chaetomiumsp.的次級代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，首次從該真菌中發(fā)現(xiàn)5個化合物，從結(jié)構(gòu)上看，5個化合物分別屬于十元環(huán)內(nèi)酯類和倍半萜類。botryolides A，B，D和decarestrictine I均為十元環(huán)內(nèi)酯(nonanolide)，屬于典型的真菌來源的聚酮類化合物，由真菌中的高度還原型聚酮合成酶負(fù)責(zé)合成。該類化合物在自然界廣泛分布，具有細(xì)胞毒性、抗菌、抗真菌和除草等廣泛的生物活性[12]。botryolides A，B和D最早分離自真菌Botryotrichumsp.(NRRL 38180)，化學(xué)結(jié)構(gòu)和絕對構(gòu)型由波譜解析方法和改良Mosher法確定，botryolides B的絕對構(gòu)型還經(jīng)過化學(xué)全合成實驗驗證[10]。前期活性評價表明，該3個化合物在100 μg/板的濃度下對人體致病菌金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌以及對農(nóng)作物致病真菌黃曲霉和輪枝樣鐮刀菌均無活性。decarestrictine I屬于結(jié)構(gòu)特殊的十元環(huán)內(nèi)酯，分子中包括一個含(Z)式雙鍵的二氫呋喃環(huán)，受到化學(xué)合成學(xué)家的關(guān)注[10,13-14]。trichothecolone為倍半萜類化合物，屬于單端孢霉烯(trichothecene)類真菌毒素，該類毒素可以由曲霉菌、青霉菌和鐮刀霉菌等真菌產(chǎn)生，在自然界廣泛存在，是污染糧食的主要毒素，能引起人類食物中毒，主要癥狀表現(xiàn)為惡心、嘔吐和厭食，主要靶器官是肝臟和腎臟[15]。trichothecolone細(xì)胞毒活性篩選表明，它對人口腔表皮樣癌(KB)，人皮膚黑色素瘤(SK-MEL 30)，人肺癌(A-459)和人乳腺癌(MCF-7)細(xì)胞株具有明顯活性，IC50值分別為10.6，8.6，7.1和10.6μg/ml[15]。海洋真菌Chaetomiumsp.中獲得的十元環(huán)內(nèi)酯類和倍半萜類，在其他種屬的真菌也見有報道，提示負(fù)責(zé)這些次級代謝產(chǎn)物的生物合成基因簇可能在真菌物種分化的早期就已經(jīng)存在，或能夠通過水平基因轉(zhuǎn)移在不同種屬之間進(jìn)行交換。