曹青青，李盛建，李云青，葛繼云，陳 俊，周 瑾，錢 躚，趙 亮

(1.上海市浦東新區(qū)人民醫(yī)院藥劑科，上海 201299；2.上海東方肝膽外科醫(yī)院藥材科，上海 200438；3.山西省兒童醫(yī)院藥劑科，山西 太原 030013；4.上海市寶山區(qū)羅店醫(yī)院藥劑科，上海 201908)

月腺大戟(EuphorbiaebracteolataHayata.)為大戟科大戟屬多年生草本植物，生于山坡、草地或林下，分布于全國(guó)，主要產(chǎn)地為安徽、江蘇、河南、湖北、山東等省。月腺大戟作為傳統(tǒng)中藥已有2000年歷史，始記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》：根入藥，性平，味辛，有大毒。功能主治：逐水散結(jié)，破積殺蟲[1]。用于治療消化不良、水腫、咳嗽、哮喘、皮癬、皮炎等疾病[2]，對(duì)于結(jié)核和癌癥的治療亦有明顯效果[3]。近年有文獻(xiàn)報(bào)道中藥月腺大戟醇提物具有抗痛風(fēng)作用[4]，其水提物對(duì)于小鼠移植性腫瘤具有明顯的抑制作用，同時(shí)提高了小鼠的免疫能力[5]。為確定該藥的藥效成分，前期從月腺大戟中分離得到了多種類型化合物，包括苯乙酮類、二萜類、三萜類以及甾醇類等[6]，其中萜類和苯乙酮類化合物表現(xiàn)出顯著的抗結(jié)核桿菌生長(zhǎng)的作用[7]，二萜和苯乙酮類化合物亦表現(xiàn)出一定細(xì)胞毒和腫瘤細(xì)胞抑制作用[8]。結(jié)合該藥物的治療作用和毒理研究，對(duì)月腺大戟的化學(xué)成分及細(xì)胞毒活性展開進(jìn)一步的研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器

AVANCE III 600高分辨核磁共振波譜儀系統(tǒng)(德國(guó)布魯克科技有限公司)；Agilent1260高效液相色譜儀、Agilent 6220飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(美國(guó)安捷倫科技有限公司)；LC-20AP制備液相色譜儀(日本島津公司)；SMART-N超純水機(jī)(香港力康生物醫(yī)療科技控股有限公司)；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司)；Multiskan MK3酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo)；CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo)；TS-100搖床(海門其林貝爾)；XDS-200倒置顯微鏡(上海蔡康光學(xué))；SB3200-T超聲發(fā)生器(上海科導(dǎo)，50 KHz,120 W)；18XW-80A型旋渦混合器(海門其林貝爾)，AE240型十萬分之一電子天平(瑞士梅特勒)；全自動(dòng)手持式細(xì)胞計(jì)數(shù)器Scepter 2.0(美國(guó)Millipore)。

1.2 材料

所用試劑(江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司)均為分析純?cè)噭?，水為本?shí)驗(yàn)室制備的超純水。玻璃層析柱(江蘇南通三晶玻璃儀器有限公司)；Kromasil 100-5 C18制備柱(50 mm×250 mm)；柱層析用硅膠、硅膠GF254薄層板(山東煙臺(tái)江友化工有限公司)；羥丙基葡聚糖凝膠Sephadex LH-20(上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，反相C18硅膠(日本大曹株式會(huì)社)。

乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231、Sum149、MCF7、ZR-75-1、SKBr3、BT474(南京科佰生物科技有限公司，來源ATCC)；紫杉醇(北京譜析)；澳洲胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、PBS溶液、0.5%胰蛋白酶(美國(guó)Gibco公司)。

中藥月腺大戟飲片購(gòu)自安徽(產(chǎn)地山東，批號(hào)：20140811)，經(jīng)第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室的韓婷副教授鑒定為大戟科大戟屬植物月腺大戟euphorbiaebracteolataHayata.的干燥根。

2 提取和分離

取月腺大戟藥材30 kg粉碎后，用8倍量體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇于65℃下依次熱提2次，每次2 h，合并2次濾液減壓回收溶劑至無醇?xì)埩?，得濃縮液體積7 L。取濃縮液2 L，分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，每次加入萃取溶劑體積2 L。分別合并各萃取層溶液，減壓回收溶劑，得石油醚浸膏50 g，乙酸乙酯浸膏135 g，正丁醇浸膏250 g。

取乙酸乙酯浸膏135 g過正相硅膠柱層析(石油醚：乙酸乙酯，50∶1～1∶1洗脫)，得到9個(gè)餾分Fr1-Fr9，分別取Fr1 (20 g)、Fr2 (20 g)用石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇(從石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇=100∶1∶1，50∶1∶1，20∶1∶1；10∶1∶1；2∶1∶1；1∶1∶1，每個(gè)體積約1.5 L)梯度洗脫，F(xiàn)r1分離得到化合物 7 (170 mg)，8 (52 mg)，9 (60 mg)；Fr2分離得到化合物 1 (45 mg)；取Fr3(15 g)、Fr4(15 g) 經(jīng)反相C18硅膠用氯仿：甲醇(氯仿：甲醇=20∶1；10∶1；5∶1；2∶1；每個(gè)體積約1.5 L)梯度洗脫，從Fr3中分離得到化合物 5(37 mg)，6(45 mg)；從Fr4中得到化合物 2 (34 mg)，3 (27 mg)；從Fr9(15 g)中經(jīng)反相C18硅膠用甲醇洗脫分離得到3個(gè)餾分：Fr9-1，F(xiàn)r9-2，F(xiàn)r9-3；對(duì)Fr9-1 (1.2 g)，F(xiàn)r9-2(1.5 g)用LH-20柱，采用甲醇水(甲醇：水=50%，洗脫體積8 L)洗脫，最后得到化合物4(25 mg)，10(26 mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

采用Agilent HPLC-ESI-TOF/MS對(duì)月腺大戟中分離得到的10個(gè)單體化合物進(jìn)行分子量和分子式的分析，采用Bruker AVANCE III 600 高分辨核磁共振波譜儀采集1H-NMR譜與13C-NMR譜數(shù)據(jù)。結(jié)合理化性質(zhì)及現(xiàn)有文獻(xiàn)中報(bào)道的核磁數(shù)據(jù)，對(duì)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，結(jié)構(gòu)詳見圖1。

化合物1：無色針晶，C10H10O5，ESI-MS的質(zhì)核比(M/Z)為211.0531 [M+H]+。1H-NMR (600 MHz,CDCl3,δ,ppm):15.39 (1H,s,3-OH),13.01 (1H,s,3-CHO),10.20 (1H,s,4-OH),5.90 (1H,s,H-5),3.98 (3H,s,6-OCH3),2.62 (3H,s,1-COCH3).13C-NMR (150 MHz,CDCl3,δ,ppm):204.8,34.2 (1-COCH3),194.0 (3-CHO),172.8 (C-4),171.7 (C-6),169.9 (C-2),106.5 (C-3),105.9 (C-1),92.2 (C-5),57.6 (6-OCH3).以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]基本一致，鑒定化合物為2,4-二羥基-6-甲氧基-3-甲酰基苯乙酮。

圖1 10個(gè)單體化合物的結(jié)構(gòu)圖

化合物2：無色針晶，C10H12O4，ESI-MS的質(zhì)核比(M/Z)為197.0721[M+H]+。1H-NMR(600 MHz,DMSO-d6,δ,ppm):14.21 (1H,s,2-OH),10.52 (1H,s,4-OH),6.04 (1H,s,H-5),3.78 (3H,s,6-OCH3),2.51 (3H,s,1-COCH3),1.85 (3H,s,H-3).13C-NMR (150 MHz,DMSO-d6,δ,ppm):204.3,34.5 (1-COCH3),165.9 (C-4),164.8 (C-6),162.7 (C-2),106.0 (C-3),104.6 (C-1),92.3 (C-5),57.4 (6-OCH3),9.2 (3-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]基本一致，推測(cè)化合物為2,4-二羥基-6-甲氧基-3-甲基苯乙酮。

化合物3：黃色針晶，C20H22O8，ESI-MS的質(zhì)核比(M/Z)為391.1126 [M+H]+。1H-NMR (600 MHz,CDCl3,δ,ppm):13.19 (1H,s,4-OH),9.15 (1H,s,6-OH),8.82 (1H,s,6′-OH),6.02 (1H,s,H-5),3.95 (3H,s,2-OCH3),3.84 (3H,s,4′-OCH3),3.74 (2H,s,CH2),2.69 (3H,s,3′-COCH3),2.63 (3H,s,3-COCH3),2.06 (3H,s,5′-CH3).13C-NMR (150 MHz,CDCl3,δ,ppm):205.2,32.9 (3-COCH3),203.7,31.9 (3,3′-COCH3),164.4 (C-6),164.1 (C-4′),164.0 (C-4),163.9 (C-2′),161.9 (C-6′),157.2 (C-2),112.2 (C-1′),112.1 (C-5′),109.0 (C-3′),106.6 (C-1),106.6 (C-3),93.8 (C-5),66.0 (4′-OCH3),57.1 (2-OCH3),17.6 (CH2),9.3 (5′-CH3).以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道基本一致，推測(cè)該化合物為月腺大戟素(ebracteolatain A)。

化合物4：淺黃色針晶，C19H20O8，ESI-MS的質(zhì)核比(M/Z)為377.1299 [M+H]+。1H-NMR (600 MHz,DMSO-d6,δ,ppm):14.20 (2H,s,2,2′-OH),10.21 (2H,s,6,6′-OH),8.30 (2H,s,5,5′-H),5.92 (6H,s,4,4′-OCH3),3.75 (2H,s,ArCH2Ar),3.62 (6H,s,6,6′-COCH3).13C-NMR (150 MHz,DMSO-d6,δ,ppm):204.1,34.6 (3,3′-COCH3),166.4 (C-6,6′),165.0 (C-4,4′),162.6 (C-2,2′),108.3 (C-1,1′),105.6 (C-3,3′),92.6 (C-5,5′),57.3 (4,4′-COCH3),17.2 (ArCH2Ar)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道基本一致，推測(cè)化合物為3,3′-乙?；?4,4′-二甲氧基-2,2′,6,6′-四羥基二苯基甲烷。

化合物5：白色針晶，C20H26O4，ESI-MS的質(zhì)核比(M/Z)為331.1183 [M+H]+。1H-NMR (600 MHz,CDCl3,δ,ppm):4.03 (1H,s,H-11),3.67 (1H,s,H-14),2.28 (1H,s,H-9),2.08 (3H,s,17-CH3),0.93 (3H,s,18-CH3),0.85 (3H,s,19-CH3),0.82 (3H,s,20-CH3)。13C-NMR (150 MHz,CDCl3,δ,ppm):171.0 (C-16),149.8 (C-13),131.6 (C-15),86.6 (C-12),67.5 (C-8),62.3 (C-11),56.8 (C-14),54.9 (C-5),49.4 (C-9),42.7 (C-1),40.6 (C-3),40.6 (C-10),37.0 (C-7),34.9 (C-4),34.9 (C-18),23.3 (C-6),22.3 (C-19),19.8 (C-2),16.8 (C-20),10.1 (C-17)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道基本一致，推測(cè)化合物為jolkinolide B。

化合物6：無色雪花狀晶體，C20H26O3，ESI-MS的質(zhì)核比(M/Z)為314.1882 [M+H]+。1H-NMR (600 MHz,CDCl3,δ,ppm):5.46 (1H,d,J=6Hz,H-11),3.70 (1H,s,H-14),2.63 (1H,d,J=6 Hz,H-9),2.06 (3H,s,H-5),0.95 (3H,s,18-CH3),0.86 (3H,s,19-CH3),0.72 (3H,s,20-CH3)。13C-NMR (150 MHz,CDCl3,δ,ppm):172.0 (C-16),148.9 (C-12),146.4 (C-13),126.6 (C-15),105.5 (C-11),62.6 (C-8),55.9 (C-14),54.9 (C-5),53.3 (C-9),43.0 (C-1),42.9 (C-10),41.3 (C-3),35.6 (C-7),34.9 (C-4),34.9 (C-18),23.3 (C-19),22.3 (C-6),19.9 (C-2),16.4 (C-20),10.1 (C-17)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報(bào)道基本一致，故鑒定該化合物為jolkinolide A。

化合物7：淡黃色油狀液體，C20H32O2，ESI-MS的質(zhì)核比(M/Z)為281.2366 [M+H]+,279.2337 [M-H]-。1H-NMR (600 MHz,CDCl3,δ,ppm):5.38 (4H,m,H-9,H-10,H-12,H-13),2.77 (1H,t,J=6.6 Hz,H-11),2.34 (1H,t,J=7.2 Hz,H-2),2.05 (2H × 2,m,H-8,H-14),1.63 (2H,p,J=7.2 Hz,H-3),1.25 (2H×7,br.s,H-4 ～ H-7,H-15 ～ H-17),0.89 (3H,t,J=7.2 Hz,H-18)。13C-NMR (150 MHz,CDCl3,δ,ppm):180.7 (C-1),131.6 (C-10),131.4 (C-12),129.5 (C-13),129.3 (C-9),35.3 (C-2),33.3 (C-16),31.1 (C-7),31.0 (C-6),30.8 (C-15),30.8 (C-5),30.6 (C-4),28.6 (C-8),28.6 (C-14),27.0 (C-11),26.1 (C-3),24.1 (C-17),15.5 (C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報(bào)道基本一致，故推斷該化合物為亞油酸(linoleic acid)，目前，月腺大戟的研究中未見該化合物的報(bào)道，本化合物首次報(bào)道于月腺大戟中。

化合物8：無色針晶，C19H28O2，ESI-MS的質(zhì)核比(M/Z)為289.2151[M+H]+。1H-NMR (600 MHz,CDCl3,δ,ppm):5.89 (1H,d,J=1.2 Hz,H-3),5.78 (1H,dd,J=10.7 Hz,15.7 Hz,H-15),4.92 (1H,s,H-5),4.87 (1H,s,H-16),1.68 (1H,m,H-8),1.62 (1H,m,H-9),1.44 (1H,t,J=12Hz,H-14),1.27 (1H,dd,J=2.9 Hz,13.7 Hz,H-12),1.21 (1H,s,H-18),1.20 (1H,s,H-20),1.14 (1H,m,H-11),1.11(1H,m,H-14),1.02 (1H,s,H-17),0.69 (1H,s,H-19)。13C-NMR (150 MHz,CDCl3,δ,ppm):185.2 (C-2),174.7 (C-4),151.4 (C-15),118.7 (C-3),110.9 (C-16),91.3 (C-5),44.7 (C-7),42.4(C-14),41.1 (C-10),41.0 (C-8),40.8 (C-9),40.5(C-6),37.4 (C-13),33.0 (C-12),31.4 (C-20),29.9 (C-11),24.0 (C-17),20.3 (C-19),20.2 (C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報(bào)道基本一致，故推測(cè)該化合物為fischeria A。目前，月腺大戟的研究中未見該化合物的報(bào)道，該化合物主要從大戟科白狼毒中研究發(fā)現(xiàn)，從月腺大戟中首次發(fā)現(xiàn)。

化合物9：無色針晶，C32H52O2，ESI-MS的質(zhì)核比(M/Z)為469.3967 [M+H]+。1H-NMR (600 MHz,CDCl3,δ,ppm):5.17 (1H,t,J=3.4 Hz,H-12),4.49 (1H,dd,J=7.7 Hz,H-3),2.04 (3H,s,CH3CO),1.13 (3H,s,CH3-27),0.97 (6H,s,CH3-25,26),0.96 (6H,s,CH3-29,30),0.87 (6H,s,CH3-23,24),0.83 (3H,s,CH3CO)。13C-NMR (150 MHz,CDCl3,δ,ppm):172.4 (C-32),146.6 (C-13),123.1 (C-12),82.4 (C-3),56.7 (C-5),49.0 (C-9),48.7 (C-18),48.2 (C-19),43.1 (C-14),41.2 (C-8),39.7 (C-1),39.1 (C-4),38.6 (C-22),38.3 (C-10),36.2 (C-21),34.7 (C-29),34.6 (C-7),33.1 (C-17),32.5 (C-20),29.8 (C-28),29.5 (C-23),28.4 (C-15),27.6 (C-16),27.4 (C-27),25.0 (C-30),25.0 (C-2),24.91 (C-11),22.3 (C-31),19.7 (C-6),19.2 (C-24),18.1 (C-26),17.0 (C-25)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報(bào)道基本一致，故推測(cè)該化合物為 β-香樹脂醇乙酸酯。

化合物10：微黃色粉末，C22H44O4，ESI-MS的質(zhì)核比(M/Z)為353.2660 [M- H2O]+。1H-NMR (600 MHz,CDCl3,δ,ppm):4.18 (2H,m),3.93 (1H,m),3.67 (2H,m)。13C-NMR (150 MHz,CDCl3,δ,ppm):175.8,71.7 (-CH),66.6 (-CH2),64.8 (-CH2)，提示該化合物有甘油酸酯片段。δH2.34 (2H,t,J=7.5 Hz)與δC35.6 是與酯羰基相連的-CH2的信號(hào)。δH0.87 (3H,t,J=6.7 Hz) 與δC15.5 是端甲基信號(hào)。以上信號(hào)與文獻(xiàn)[18]對(duì)照，推斷該化合物為單十九酸甘油酯，該化合物首次在月腺大戟研究中報(bào)道。

4 細(xì)胞毒活性試驗(yàn)

采用MTT法對(duì)提取得到的苯乙酮類成分進(jìn)行細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)，選取6種類型乳腺癌細(xì)胞，分別為三陰性乳腺癌MDA-MB-231及Sum149；LuminalA型MCF-7，LuminalB型ZR-75-1，Her 2陽性型SKBr3及BT474。將上述6種乳腺癌細(xì)胞接種到96孔培養(yǎng)板中，置于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。設(shè)置陽性對(duì)照組，腫瘤細(xì)胞對(duì)照組和各個(gè)不同濃度藥物的實(shí)驗(yàn)組。配置化合物1-4母液濃度為5 mmol/L母液經(jīng)稀釋得到8個(gè)梯度濃度的樣品溶液，濃度分別為20、15、12.5、10、7.5、5、2、1 μmol/L，作用于6種乳腺癌細(xì)胞，每個(gè)劑量設(shè)6個(gè)平行孔。各分別置于37℃、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，之后每孔加入MTT。繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀(波長(zhǎng)492 nm)測(cè)定吸光度(OD)值，計(jì)算不同濃度的化合物對(duì)乳腺癌細(xì)胞的抑制率。

細(xì)胞抑制率=(加藥組OD值-調(diào)零孔OD值)/(對(duì)照組OD值-調(diào)零孔OD值)，結(jié)果如表1所示。

表1 MTT法測(cè)定4個(gè)化合物對(duì)各乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響(72 h，n=6)

注：“-” 表示沒有活性；20 μmol(30%)表示給藥濃度20 μmol時(shí)抑制率為30%

5 討論

本次研究采用多種分離技術(shù)和鑒別方法對(duì)月腺大戟的化學(xué)成分開展了進(jìn)一步研究，從中分離10個(gè)化合物，并對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析。其中分析得到4個(gè)苯乙酮類化合物，3個(gè)二萜類化合物，1個(gè)三萜類化合物和2個(gè)脂肪酸酯類化合物?；衔?、7、8、10為首次從該植物中分離得到。采用MTT法選用6種乳腺癌細(xì)胞測(cè)試 4 個(gè)苯乙酮類化合物的抗乳腺癌活性，化合物3顯示出明顯的抗乳腺癌活性，化合物4對(duì)乳腺癌細(xì)胞抑制活性較弱，化合物1和化合物2未表現(xiàn)出生物活性?；衔?和化合物2均為單苯乙酮化合物，化合物3和化合物4均為雙苯乙酮類化合物，化合物3為對(duì)稱的甲基取代對(duì)稱的雙苯乙酮，化合物4為非對(duì)稱的無甲基取代對(duì)稱的雙苯乙酮，化合物3對(duì)抗乳腺癌細(xì)胞的生物活性較化合物4顯著，而單苯乙酮類化合物1和化合物2對(duì)乳腺癌細(xì)胞未表現(xiàn)出抑制活性。因此，本研究初步探討了苯乙酮類化合物的構(gòu)效關(guān)系，為月腺大戟的抗乳腺癌活性開發(fā)及質(zhì)量控制提供一定的物質(zhì)基礎(chǔ)和參考依據(jù)。