張 虹，王 彤，王 坤，王博深，章夢(mèng)瑩，周燕華，浦躍樸，張 娟*

(東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，環(huán)境醫(yī)學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210009)

苯是一種常見的工業(yè)基本原料，也是環(huán)境中重要的污染物，苯通過(guò)不同途徑進(jìn)入機(jī)體后，經(jīng)過(guò)一系列代謝，最后在骨髓生成終致癌物1,4-苯醌(1,4-benzoquinone，1,4-BQ)[1-2]。慢性苯暴露可影響骨髓造血功能，引起白細(xì)胞減少，再障，骨髓增生異常綜合征，甚至白血病[3-6]。1,4-BQ可以誘導(dǎo)K562細(xì)胞活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)增加，導(dǎo)致線粒體損傷和細(xì)胞凋亡增加[7]。鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶2(calcium/calmodulindependentproteinkinase2，Camk2)是一種多功能蛋白激酶，能夠根據(jù)Ca2+濃度的改變傳遞不同的細(xì)胞信號(hào)[8-9]，細(xì)胞內(nèi)鈣離子的超載會(huì)造成線粒體功能障礙，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[10]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，苯暴露可致葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺陷小鼠骨髓細(xì)胞Camk2b的表達(dá)降低[11]，故本研究通過(guò)構(gòu)建Camk2b低表達(dá)K562細(xì)胞，在不同濃度的1,4-BQ染毒后檢測(cè)細(xì)胞增殖、活性氧、ATP、線粒體膜電位、凋亡的改變，探討Camk2b低表達(dá)對(duì)苯致K562細(xì)胞線粒體毒性的影響，初步研究Camk2b對(duì)于細(xì)胞抗氧化損傷的作用和意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

K562細(xì)胞株，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清均購(gòu)于美國(guó)Gibco公司。青霉素、鏈霉素均購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司。PrimeScriptTMRTMasterMix、SYBR?PremixExTaqTM均購(gòu)于日本TaKaRa公司?；钚匝鯔z測(cè)試劑盒、JC-1線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒、Fluo-3AM鈣離子熒光探針均購(gòu)于上海碧云天公司。ATP檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于江蘇凱基公司。Anti-CamkⅡbeta antibody、Anti-betaActinantibody均購(gòu)于美國(guó)Abcam公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 熒光定量PCR法檢測(cè)K562細(xì)胞Camk2b mRNA水平的表達(dá) 選取狀態(tài)良好的K562細(xì)胞，用含有5%(體積分?jǐn)?shù))血清和0.5%(體積分?jǐn)?shù))雙抗的1640培養(yǎng)基重懸，以每孔3×105個(gè)細(xì)胞、2mL培養(yǎng)液接種于6孔板。分別以0、10、20μmol/L1,4-BQ染毒，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行，培養(yǎng)24h，收集細(xì)胞后加入Trizol提取RNA，引物序列見表1，逆轉(zhuǎn)錄(體系為500ngRNA，20 μL5×PrimeScriptRTMastermix，無(wú)酶水補(bǔ)充至體系總體積為20μL)后進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95℃，30s；95℃，5s；60℃，30s；95℃，15s；60℃，1min；95℃，15s；共40個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，用 2-ΔΔCT法計(jì)算Camk2bmRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

表1 基因引物序列

1.2.2 熒光定量PCR法檢測(cè)KN93干預(yù)細(xì)胞Camk2b mRNA表達(dá)水平 根據(jù)參考文獻(xiàn)[12-13]及預(yù)實(shí)驗(yàn)，選擇15μmol/L濃度的抑制劑KN93干預(yù)細(xì)胞，設(shè)置3個(gè)平行，培養(yǎng)24h。收集細(xì)胞后加入Trizol提取RNA，引物序列同表1，逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR反應(yīng)同1.2.1。 以 β-actin 為 內(nèi)參， 用 2-ΔΔCT法計(jì)算Camk2b mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.3 Westernblot法檢測(cè)KN93干預(yù)細(xì)胞Camk2b蛋白的表達(dá)水平 以15μmol/L濃度的抑制劑KN93干預(yù)細(xì)胞，設(shè)置3個(gè)平行，培養(yǎng)24h。收集細(xì)胞后加入RIPA提取蛋白，通過(guò)BCA法檢測(cè)蛋白濃度，取25g蛋白上樣，通過(guò)制備濃縮膠和分離膠，SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝膠)電泳(條件為70V、30min，100V、60min)，轉(zhuǎn)膜(條件為90V、3h)，5%脫脂奶粉封閉，分別加入1∶1000稀釋Camk2b的一抗和1∶2000稀釋?duì)?actin的一抗4℃孵育過(guò)夜，1×TBST緩沖液清洗后用1∶5000稀釋的二抗孵育1h，1×TBST和1×TBS緩沖液清洗后曝光，測(cè)定細(xì)胞蛋白表達(dá)量。

1.2.4 細(xì)胞分組及處理 將Camk2b低表達(dá)細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞分別以0、10、20μmol/L1,4-BQ染毒，共分為 0、 10、 20 μmol/L1,4-BQ， KN93， KN93+10 μmol/L，KN93+20μmol/L1,4-BQ共6個(gè)組，每個(gè)組設(shè)置3個(gè)平行，抑制劑KN93提前1h加入。

1.2.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率 以每孔8000個(gè)細(xì)胞、200μL培養(yǎng)液的濃度接種于96孔板，分組同1.2.4，每組設(shè)置3個(gè)平行，同時(shí)用培養(yǎng)基設(shè)置空白對(duì)照組，用PBS加在各組最外圈防止邊緣效應(yīng)，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞分別培養(yǎng)24h。干預(yù)24h后每孔加入20μL MTT溶液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，然后將96孔板以1500r/min離心10min，去上清，每孔加入150 μLDMSO溶液溶解藍(lán)紫色結(jié)晶，在490nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度D(490)值，按公式計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖率。

1.2.6 細(xì)胞活性氧檢測(cè) 按照1∶1000的稀釋比用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10 μmol/L。細(xì)胞分組同1.2.4，每組設(shè)置3個(gè)平行，培養(yǎng)2h后每個(gè)平行收集1×105個(gè)細(xì)胞，1500r/min離心，5min，去除上清。將離心后的細(xì)胞重懸于稀釋后的DCFH-DA中，細(xì)胞濃度為1×106/mL，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育20min。在孵育期間，每隔3～5min顛倒混勻一下，使細(xì)胞和探針充分接觸。孵育結(jié)束后，洗滌細(xì)胞3次，1500r/min離心5min，盡快上機(jī)檢測(cè)。

1.2.7 細(xì)胞ATP檢測(cè) 細(xì)胞分組同1.2.4，每組設(shè)置3個(gè)平行，培養(yǎng)24h后每個(gè)平行收集2×105個(gè)細(xì)胞并離心，棄上清，每2×105個(gè)細(xì)胞加入200μL裂解液，待裂解充分后，4℃、12000g離心5min，輕輕吸取上清待用。將ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成0.01、0.05、0.2、1、5、10和50μmol/L幾個(gè)濃度，用于測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線。按照ATP檢測(cè)試劑：ATP檢測(cè)試劑稀釋液=1∶9的比例配制適當(dāng)量的ATP檢測(cè)工作液，每個(gè)樣品/標(biāo)準(zhǔn)品100μL。在檢測(cè)孔內(nèi)加上40μL樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，迅速混勻，間隔3s后，用微孔板式發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)。

1.2.8 細(xì)胞JC-1膜電位檢測(cè) 用超純水稀釋溶解并混勻JC-1，再加入2mLJC-1染色緩沖液(5X)，配制染色工作液。細(xì)胞分組同1.2.4，每組設(shè)置3個(gè)平行，染毒結(jié)束24h后，每個(gè)平行收集2×105個(gè)細(xì)胞重懸于0.5mL細(xì)胞培養(yǎng)液中，再加入0.5mLJC-1染色工作液，混勻，37℃孵育20min。按照J(rèn)C-1染色緩沖液(5X)∶蒸餾水=1∶4的比例，配制JC-1染色緩沖液(1X)，冰上保存。37℃孵育結(jié)束后，600g、4℃離心3～4min，棄上清，用JC-1染色緩沖液(1X)洗滌細(xì)胞，600g、4℃離心3min，再重復(fù)洗滌一次。用適量JC-1染色緩沖液(1X)重懸細(xì)胞，盡快用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。綠色熒光值越高，細(xì)胞線粒體膜電位越低。

1.2.9 細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度檢測(cè) 細(xì)胞分組同1.2.4，每組設(shè)置3個(gè)平行，染毒24h后每個(gè)平行收集等量的細(xì)胞，離心5min，棄上清。將5mmol/L的Fluo-3AM熒光探針用DMSO稀釋成5μmol/L待用，注意避光保存。Fluo-3可以和鈣離子結(jié)合，結(jié)合鈣離子后可以產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光。用稀釋好的5μmol/L的Fluo-3AM熒光探針重懸細(xì)胞，37℃孵育50min，無(wú)菌PBS洗滌細(xì)胞，再孵育20min，盡快用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度。

1.2.10 細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 細(xì)胞分組同1.2.4，每組設(shè)置3個(gè)平行，染毒24h后每個(gè)平行收集(1～5)×105個(gè)細(xì)胞，1500r/min離心5min，PBS洗滌兩次，1500r/min離心5min。每個(gè)平行加入500μL的BindingBuffer和5μLAnnexinV-PE混勻后，加入5μLPI染液混勻，室溫、避光、反應(yīng)5～15min，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。AnnexinV是檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)，用熒光素APC標(biāo)記；PI是一種核酸染料，能透過(guò)晚期凋亡細(xì)胞和死細(xì)胞的細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染紅。AnnexinV陽(yáng)性PI陰性為早期凋亡細(xì)胞，AnnexinV和PI雙陽(yáng)性為晚期凋亡細(xì)胞。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 K562細(xì)胞Camk2bmRNA水平的表達(dá)

通過(guò)qPCR法檢測(cè)Camk2bmRNA的表達(dá)，結(jié)果如圖1所示，在1,4-BQ染毒后，與未染毒組比較，K562細(xì)胞Camk2bmRNA表達(dá)量明顯下降，呈劑量反應(yīng)關(guān)系，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

圖1 1,4-BQ染毒K562細(xì)胞后Camk2bmRNA的相對(duì)表達(dá)水平

2.2 KN93干預(yù)后K562細(xì)胞Camk2bmRNA水平的表達(dá)

通過(guò)qPCR法檢測(cè)Camk2bmRNA的表達(dá)，在15 μmol/LKN93干預(yù)后，K562細(xì)胞Camk2bmRNA表達(dá)量與對(duì)照組比較，下降71%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，如圖2所示。

圖2 KN93干預(yù)K562細(xì)胞后Camk2bmRNA的相對(duì)表達(dá)水平

2.3 KN93干預(yù)后K562細(xì)胞Camk2b蛋白水平的表達(dá)

通過(guò)Westernblot法檢測(cè)Camk2b蛋白表達(dá)的結(jié)果如圖3所示，在15μmol/LKN93干預(yù)后，K562細(xì)胞Camk2b蛋白表達(dá)量與對(duì)照細(xì)胞比較，下降46%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

圖3 KN93干預(yù)K562細(xì)胞后Camk2b蛋白的相對(duì)水平表達(dá)

2.4 KN93干預(yù)對(duì)苯致K562細(xì)胞增殖活性的影響

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，在1,4-BQ染毒后，Camk2b低表達(dá)細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞都出現(xiàn)明顯的增殖抑制作用，且呈劑量反應(yīng)關(guān)系。與對(duì)照細(xì)胞相比，Camk2b低表達(dá)細(xì)胞在相同濃度1,4-BQ作用下細(xì)胞增殖率降低(P＜0.01)。

圖4 KN93對(duì)苯致K562細(xì)胞增殖活性的影響

2.5 KN93干預(yù)對(duì)苯致K562細(xì)胞ROS的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果如圖5所示，在1,4-BQ染毒后，Camk2b低表達(dá)細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞產(chǎn)生的ROS均增加，在10μmol/L的濃度下ROS上升為原來(lái)的1.41倍和1.6倍，Camk2b低表達(dá)細(xì)胞的活性氧上升更為明顯(P＜0.05)。在20μmol/L的濃度下，對(duì)照細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧仍在上升，而Camk2b低表達(dá)細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧則開始下降，但仍然高于未染毒細(xì)胞。

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Camk2b抑制劑KN93對(duì)苯染毒后K562細(xì)胞ROS的影響

2.6 KN93干預(yù)對(duì)苯致K562細(xì)胞ATP的影響

用微孔板式發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)細(xì)胞線粒體的ATP生成量，如圖6所示。Camk2b低表達(dá)細(xì)胞線粒體ATP生成量低于對(duì)照細(xì)胞(P＜0.01)。在1,4-BQ染毒后，兩種細(xì)胞線粒體ATP生成量均降低，且呈劑量反應(yīng)關(guān)系。但在相同濃度1,4-BQ染毒后，與對(duì)照細(xì)胞比較，Camk2b低表達(dá)細(xì)胞線粒體ATP生成量更低(P＜0.01)。

圖6 Camk2b抑制劑KN93對(duì)苯致K562細(xì)胞ATP生成量的影響

2.7 KN93干預(yù)對(duì)苯致K562細(xì)胞線粒體膜電位的影響

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果如圖7所示，相較于對(duì)照細(xì)胞，Camk2b低表達(dá)細(xì)胞的綠色熒光值更高，提示Camk2b抑制劑KN93干預(yù)后，線粒體膜電位下降(P＜0.01)。隨著1,4-BQ染毒濃度的增加，紅色熒光減弱，綠色熒光增強(qiáng)，紅綠熒光比值降低，說(shuō)明兩種細(xì)胞線粒體膜電位均降低，且呈劑量反應(yīng)關(guān)系。在10 μmol/L1,4-BQ染毒后，與對(duì)照細(xì)胞比較，Camk2b低表達(dá)細(xì)胞線粒體膜電位下降更顯著(P＜0.05)。但在20 μmol/L1,4-BQ染毒后，兩種細(xì)胞線粒體膜電位都明顯下降，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖7 Camk2b抑制劑KN93對(duì)苯致K562細(xì)胞線粒體膜電位的影響

2.8 KN93干預(yù)對(duì)苯致K562細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果如圖8所示，Camk2b低表達(dá)細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度高于對(duì)照細(xì)胞(P＜0.01)。在1,4-BQ染毒后，兩種細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度均增加，且呈劑量反應(yīng)關(guān)系，但在相同濃度1,4-BQ染毒后，與對(duì)照細(xì)胞比較，Camk2b低表達(dá)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度更高(P＜0.01)。

2.9 KN93干預(yù)對(duì)苯致K562細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果如圖9所示，Camk2b低表達(dá)細(xì)胞的早期凋亡率和晚期凋亡率都高于對(duì)照細(xì)胞，提示抑制Camk2b基因后細(xì)胞凋亡明顯增加。在1,4-BQ染毒后，Camk2b低表達(dá)細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞的晚期凋亡率都增加，且呈劑量反應(yīng)關(guān)系，而且與對(duì)照細(xì)胞比較，Camk2b低表達(dá)細(xì)胞在相同濃度1,4-BQ染毒后晚期凋亡率更高。而Camk2b低表達(dá)細(xì)胞早期凋亡率在20 μmol/L的濃度開始下降，由早期凋亡逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橥砥诘蛲觥?/p>

3 討論

線粒體主要功能是高效地為細(xì)胞生命活動(dòng)的提供能源ATP與細(xì)胞中氧自由基的生成，調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原電位和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞內(nèi)多種離子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)及電解質(zhì)穩(wěn)態(tài)平衡，調(diào)控細(xì)胞凋亡[14-15]。線粒體損傷主要表現(xiàn)在氧化磷酸化障礙，ATP生成受阻，膜電位降低，鈣離子濃度失衡，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死[16-17]。

圖8 Camk2b抑制劑KN93對(duì)苯致K562細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響

圖9 Camk2b抑制劑KN93對(duì)苯致K562細(xì)胞凋亡的影響

本次研究中，首先發(fā)現(xiàn)在1,4-BQ染毒后，K562細(xì)胞Camk2bmRNA表達(dá)量下降。建立Camk2b低表達(dá)細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)在1,4-BQ染毒后，Camk2b低表達(dá)與對(duì)照細(xì)胞增殖都受到明顯的抑制，ATP生成減少，線粒體膜電位下降，產(chǎn)生的活性氧增加，出現(xiàn)明顯的線粒體損傷。Camk2b低表達(dá)細(xì)胞由于鈣/鈣調(diào)素依賴蛋白激酶受到抑制，在20μmol/L1,4-BQ染毒后，ATP生成急劇減少，線粒體膜電位顯著下降，胞內(nèi)鈣離子過(guò)載，表現(xiàn)為更加明顯的線粒體損傷。適當(dāng)濃度的ROS是細(xì)胞正常生理過(guò)程所必須的，過(guò)度的ROS產(chǎn)生可能導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙或死亡[18]。本研究中1,4-BQ染毒后ROS顯著升高，可引起過(guò)度的氧化應(yīng)激，但20 μmol/L1,4-BQ染毒之后，Camk2b低表達(dá)細(xì)胞與正常表達(dá)組相比，ROS水平出現(xiàn)下降，這可能與高濃度1,4-BQ對(duì)線粒體有氧呼吸的抑制有關(guān)。

鈣離子是普遍存在的參與控制多種生理過(guò)程的第二信使，通過(guò)抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白微調(diào)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的穩(wěn)態(tài)[19]。鈣離子的過(guò)載導(dǎo)致細(xì)胞活性氧的產(chǎn)生增加以及線粒體鈣離子循環(huán)可能通過(guò)通透性轉(zhuǎn)換孔的開放導(dǎo)致線粒體去極化，最終導(dǎo)致線粒體功能障礙和細(xì)胞凋亡，產(chǎn)生不利影響[20-21]。細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的變化調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程，包括細(xì)胞增殖，遷移和死亡[22]。有研究顯示，Camk2b具有廣泛的生物學(xué)功能，是細(xì)胞增殖的重要調(diào)節(jié)因子[23]，抑制Camk2b的活性會(huì)限制白血病細(xì)胞的增殖，并導(dǎo)致生長(zhǎng)停滯和分化[24]。本研究顯示在1,4-BQ染毒后，Camk2b低表達(dá)細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)更高的細(xì)胞凋亡率和增殖抑制率。

綜上所述，在1,4-BQ染毒后，Camk2b低表達(dá)細(xì)胞出現(xiàn)更明顯的線粒體損傷，Camk2b對(duì)于細(xì)胞的抗氧化損傷具有重要意義。