曾 蕾，徐雪蓮，羅曼曼，張 凡，韓志堅(jiān)，李玉民，，*

(1.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院普外科，甘肅 蘭州730030；2.甘肅省消化系統(tǒng)腫瘤重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730030)

胃癌是消化道最常見的惡性腫瘤，我國胃癌發(fā)病率及死亡率顯著高于其他國家，嚴(yán)重威脅人類健康[1]。由于早期胃癌無特異性改變，大多患者發(fā)現(xiàn)已經(jīng)處于進(jìn)展期[2-3]，手術(shù)、輔助放化療的快速發(fā)展在一定程度上提高了胃癌患者的生存期，但由于化學(xué)藥物抗性等原因胃癌患者的5年生存率僅為5%～15%[4-5]。因此識別胃癌相關(guān)的分子標(biāo)志物，為胃癌患者提供個體化治療以提高治療效果尤為重要。然而目前關(guān)于胃癌分子機(jī)制的探究仍然處于探索階段。雖然關(guān)于這些異常的分子和信號通路已被用做藥物干預(yù)的靶點(diǎn)來治療胃癌，但是關(guān)于胃癌的藥物治療仍然比較局限。因此，對胃癌發(fā)生發(fā)展過程中分子機(jī)制的研究至關(guān)重要。

基因芯片技術(shù)和生物信息學(xué)分析方法為疾病分子機(jī)制的研究提供了新的思路，是目前探究疾病發(fā)展過程中基因調(diào)控最好的方法[6]。因此，本文擬通過下載GEO數(shù)據(jù)庫中5個基因芯片數(shù)據(jù)集的原始數(shù)據(jù)，利用生物信息學(xué)的研究方法，分析胃癌發(fā)生發(fā)展過程中關(guān)鍵的基因和信號通路，從而為胃癌分子機(jī)制的研究提供新的方向，為胃癌的診斷和治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

通過NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫下載GSE35809、GSE54129、 GSE79973、GSE66229和 GSE51105共 5個數(shù)據(jù)集，基因芯片均基于Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array，數(shù)據(jù)類型為Expression profiling by array，種屬為Homo sapiens；提取數(shù)據(jù)集中的基因芯片數(shù)據(jù)，并將5個數(shù)據(jù)集的的樣本分為胃癌組和正常組：胃癌組585例，正常組131例。詳見表1。

表1 各數(shù)據(jù)集中樣本分布情況

1.2 數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理和差異基因的篩選

通過Transcriptome Analysis Console軟件對下載的5個基因數(shù)據(jù)集進(jìn)行Robust multi-chip average(RMA)歸一化處理，然后利用R-package Combat去除批次效應(yīng)(batch effects)。然后通過R語言中的Limma包分析得出胃癌組與正常組之間的差異基因。以校正后的P＜0.01，|log2FC|＞1為篩選標(biāo)準(zhǔn)，得到胃癌組和正常組之間的差異基因。

1.3 GO分析和KEGG分析

DAVID數(shù)據(jù)庫[7]是一個可進(jìn)行差異基因功能富集分析的生物信息數(shù)據(jù)庫，可從生物過程(biological process，BP)、通過細(xì)胞組分(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)3個方面對我們分析得到的差異基因進(jìn)行了全面的注釋。我們用DAVID6.8對差異基因分別進(jìn)行基因本體論分析(gene ontology，GO)分析，并利用KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行KEGG分析，篩選得到參與胃癌發(fā)展過程中關(guān)鍵的通路。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)和Hub基因

STRING數(shù)據(jù)庫是可以預(yù)測蛋白質(zhì)間的相互作用的數(shù)據(jù)庫。利用STRING數(shù)據(jù)庫分析胃癌組和正常組之間差異基因間的相互作用，并將PPI網(wǎng)絡(luò)的tsv文件導(dǎo)出，利用Cytoscape3.7.0軟件對其進(jìn)行可視化，并利用軟件中的CytoHubba插件通過MCC算法對PPI網(wǎng)絡(luò)中相互作用的基因進(jìn)行評分以此得出Hub基因。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)質(zhì)量控制和差異基因的篩選

通過對數(shù)據(jù)集進(jìn)行Q-Qplot統(tǒng)計(jì)分析，說明所有基因的表達(dá)符合正態(tài)分布，可以做密度圖，兩線沒有重復(fù)的部分為差異表達(dá)基因，上下兩圖為批次效應(yīng)處理前后的基因表達(dá)情況，下圖的密度圖比上圖擬合程度更高，說明批次效應(yīng)處理成功(如圖1)。對基因表達(dá)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，并利用主成分分析(PCA分析)表明樣本之間的相似程度，不同樣本在空間上距離越近，則說明樣本間的差異越小(如圖2)，表明數(shù)據(jù)質(zhì)量可靠，可進(jìn)行生物信息學(xué)分析。我們利用R語言中的limma包分析得到胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的差異基因，總共得到1205個差異基因：上調(diào)基因480個，下調(diào)基因725個，差異基因的位置如圖3所示。

2.2 GO分析和KEGG分析

圖1 不同樣本間批次效應(yīng)處理前后基因表達(dá)情況

圖2 所有樣本主成分分析結(jié)果

對480個上調(diào)基因和725個下調(diào)基因分別進(jìn)行GO分析和KEGG分析(如表2，表3)。480個上調(diào)基因富集結(jié)果顯示，差異基因主要參與了BP的趨化因子介導(dǎo)的信號通路、細(xì)胞-細(xì)胞信號傳導(dǎo)、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞對白細(xì)胞介素-1反應(yīng)等過程；CC主要聚集于細(xì)胞外的區(qū)域；MF主要與趨化因子活性、蛋白質(zhì)結(jié)合、細(xì)胞因子活性、微管運(yùn)動活動和生長因子活動等相關(guān)。上調(diào)基因KEGG分析結(jié)果顯示，胃癌的發(fā)生發(fā)展主要與趨化因子信號通路、p53信號通路、Toll樣受體信號通路、ECM-受體相互作用、TNF信號通路、NF-κB信號通路、PI3K-Akt信號通路和Jak-STAT信號通路等通路相關(guān)。725個下調(diào)基因GO分析結(jié)果顯示，BP主要與異生素葡萄糖醛酸化、異生素代謝過程、細(xì)胞粘附、代謝過程和受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用等過程；CC表明下調(diào)基因主要位于細(xì)胞外的區(qū)域；MF結(jié)果顯示差異基因主要富集于葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶活性、細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分、鈣通道調(diào)節(jié)劑活性、酶抑制劑活性、氧化還原酶活性和生長因子活動等過程。KEGG結(jié)果顯示，下調(diào)基因主要參與了抗壞血酸和新陳代謝、戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉(zhuǎn)化、胃酸分泌、卟啉和葉綠素代謝和酪氨酸代謝等通路。

圖3 胃癌差異基因表達(dá)譜的火山圖

表2 上調(diào)基因GO分析和KEGG分析

表3 下調(diào)基因GO分析和KEGG分析

將篩選出來的1205個差異基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫，然后將所得的PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)的tsv文件數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件，對其進(jìn)行可視處理，結(jié)果如圖4所示。通過插件cytoHubba，利用MCC算法將差異基因按照相互作用的重要性進(jìn)行排序，找出CENPE、KIF15、MELK、KIF2C、CENPF、KIF11、NUSAP1、UBE2C、TTK、AURKB、DLGAP5、TOP2A、CCNA2、CCNB1、 PBK、 TPX2、 RRM2、 KIF20A、 CDCA8、CCNB2、 BUB1B、 MAD2L1、 HMMR、 CEP55、BUB1、KIF23、NCAPG、ASPM和CDK1等29個Hub基因(圖 5)。

3 討論

圖4 胃癌差異基因的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)

圖5 胃癌Hub基因網(wǎng)絡(luò)圖

胃癌是世界上常見惡性腫瘤之一[1]，目前胃癌機(jī)制的研究表明，胃癌的發(fā)生和發(fā)展與癌基因、抑癌基因、癌細(xì)胞非整倍性和幽門螺旋桿菌感染后引起的基因改變等機(jī)制相關(guān)[8-11]。對于參與這些機(jī)制的分子進(jìn)行了大量的研究，BUB1、MAD2和p53等在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用已有定論[12-14]。然而目前關(guān)于參與胃癌發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制的研究仍然處于探索階段，因此對于胃癌靶點(diǎn)治療的研究仍然比較局限。本研究通過生物信息學(xué)對585個胃癌組織和131個正常組織的基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，通過對GSE35809、GSE54129、GSE79973、GSE66229和GSE51105共5個數(shù)據(jù)集中的基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理及質(zhì)量控制，結(jié)果表明數(shù)據(jù)的異質(zhì)性小，可用于生物信息學(xué)分析。我們通過生信分析得到了1205個差異表達(dá)的基因，包括480個上調(diào)基因以及725個下調(diào)基因。

對480個上調(diào)基因以及725個下調(diào)基因進(jìn)行GO分析的結(jié)果顯示，上調(diào)基因富集結(jié)果顯示，差異基因主要參與趨化因子介導(dǎo)的信號通路、細(xì)胞-細(xì)胞信號傳導(dǎo)、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞對白細(xì)胞介素-1反應(yīng)等過程。下調(diào)基因主要與異生素葡萄糖醛酸化、異生素代謝過程、細(xì)胞粘附、代謝過程和受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用等過程。所有的差異基因主要位于細(xì)胞外的區(qū)域。趨化因子信號通路、炎癥反應(yīng)、白細(xì)胞介素-1反應(yīng)和細(xì)胞粘附等機(jī)制在胃癌發(fā)展過程中的作用均已有研究證明[15-18]。因此對于參與這些生物過程的差異基因的探究，有助于我們對胃癌分子機(jī)制的認(rèn)識。KEGG通路分析結(jié)果顯示在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中p53信號通路、PI3K-Akt信號通路、NF-κB信號通路、細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用通路(ECM-receptorinteraction)等有著重要的作用。研究表明[19-20]，PI3K/Akt信號通路與胃癌的預(yù)后相關(guān)，抑制該信號通路后胃癌生長顯著受限，因此該通路有可能成為胃癌治療的靶點(diǎn)。NF-κB是一種多功能的核轉(zhuǎn)錄因子，其與胃癌細(xì)胞增殖、凋亡、炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)等過程關(guān)系密切，抑制該信號通路促進(jìn)了胃癌細(xì)胞的凋亡，在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要作用[21]。PI3K-Akt信號通路和JAK-STAT信號通路在胃癌中的作用均已有研究證明[19，22]。然而目前，Toll樣受體信號通路、TNF信號通路和HIF-1信號通路在胃癌發(fā)展過程中的作用機(jī)制尚未報道，這些信號通路為胃癌的分子機(jī)制的研究提供了新的方向。

我們從1205個差異基因的PPI網(wǎng)絡(luò)篩選出了CENPE、 KIF15、 MELK、 KIF2C、 CENPF、 KIF11、NUSAP1、UBE2C、TTK和TOP2A等29個Hub基因。TOP2A是Ⅱ型拓?fù)洚悩?gòu)酶家族中的一員，能夠改變DNA轉(zhuǎn)錄過程中出現(xiàn)的DNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)[23]。Terashima等[24]研究表明，TOP2A的高表達(dá)增加了Ⅱ/Ⅲ期胃癌患者的血源性復(fù)發(fā)的風(fēng)險。此外，該基因在鼻咽癌、結(jié)腸癌和卵巢癌中也高表達(dá)，因此該分子有可能成為腫瘤診斷和治療的靶點(diǎn)[25-27]。泛素結(jié)合酶E2C(UBE2C)是E2家族的成員，由人染色體20q13.12的UbcH10基因編碼[28]。Zhang等[29]研究表明，UBE2C在胃癌細(xì)胞(特別是腸型胃癌細(xì)胞)呈高表達(dá)，可以通過ERK信號通路促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖，是腸型胃癌預(yù)后不良的分子標(biāo)記物。母系胚胎亮氨酸拉鏈蛋白激酶(MELK)是絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶家族中的一員，在胃癌細(xì)胞中呈高表達(dá)，通過FAK-Paxillin通路促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲，是胃癌預(yù)后不良的指標(biāo)[30-31]。CCNB1、CCNA2和CCNB2同屬于細(xì)胞周期蛋白這一家族，在調(diào)控真核細(xì)胞周期中扮演著重要作用[32]。相關(guān)研究表明CCNB1、CCNA2和CCNB2在胃癌中呈高表達(dá)，CCNB1的表達(dá)與胃癌患者的生存率相關(guān)[33]。PBK、TPX2、RRM2和CEP55均在胃癌中高表達(dá)，可通過PI3K-AKT和NF-κB信號通路等促進(jìn)胃癌的侵襲及轉(zhuǎn)移，是胃癌預(yù)后重要的生物標(biāo)志物[34-37]。紡錘體組裝檢查點(diǎn)(spindleassemblycheckpoint，SAC)蛋白的表達(dá)可導(dǎo)致有絲分裂過程中染色體的錯聚和非整倍體，該機(jī)制可能在胃癌的機(jī)制中有著重要的作用[38]。關(guān)于Hub基因CDK1、TPX2、AURKB、CDCA8、KIF11和KIF20A在胃癌中的作用機(jī)制有待進(jìn)一步探究。然而，KIF15、DLGAP5、TTK、CENPF、KIF23、NUSAP1和NCAPG的研究尚未報道，為我們對于胃癌分子機(jī)制的研究提供了新的思路。

綜上所述，通過生物信息學(xué)分析確定了可能參與胃癌發(fā)生及發(fā)展的1205個差異基因及29個Hub基因，通過GO和KEGG分析確定了Toll樣受體信號通路、TNF信號通路和HIF-1信號通路可能參與胃癌的發(fā)生及發(fā)展，關(guān)于KIF15、DLGAP5、TTK、CENPF、KIF23、NUSAP1和NCAPG等基因在胃癌中的作用機(jī)制有待進(jìn)一步探究。