蔣秀娣,姚曉陽(yáng),段愛(ài)華,項(xiàng)舟弘

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬第七人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200137)

結(jié)核病是一種傳染病，通常由結(jié)核分枝桿菌(MTB)引起，潛伏性肺結(jié)核往往沒(méi)有明顯癥狀，其中10%會(huì)發(fā)展為活動(dòng)性疾病，危及生命[1]。中性粒細(xì)胞是先天免疫系統(tǒng)重要組成部分，屬于多形核細(xì)胞家族(PMN)，當(dāng)機(jī)體受MTB感染時(shí)，中性粒細(xì)胞通過(guò)血液向受感染部位遷移，因此其是急性炎癥的標(biāo)志[2-3]。研究表明，PMN受細(xì)胞因子吸引的免疫反應(yīng)可能與抗結(jié)合病細(xì)菌感染相關(guān)，并在早期感染期間起防御作用[4]。其次，Toll樣受體(TLRs)通常在前體細(xì)胞如巨噬細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞上表達(dá)，是一種單跨膜非催化受體，當(dāng)感染源到達(dá)物理屏障如皮膚或腸道黏膜時(shí)，它們會(huì)被TLRs識(shí)別從而激活免疫反應(yīng)[5]。因此本文就MTB感染期間，中性粒細(xì)胞和TLRs表達(dá)情況及其對(duì)機(jī)體免疫反應(yīng)產(chǎn)生的影響展開(kāi)研究，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 篩取2016年10月至2018年3月來(lái)本院呼吸內(nèi)科就診的患者作為研究對(duì)象；納入標(biāo)準(zhǔn)：診斷為結(jié)核病，體質(zhì)量減輕，持續(xù)咳嗽和發(fā)燒2周以上，痰涂片抗酸桿菌(AFB涂片)呈陽(yáng)性；排除標(biāo)準(zhǔn)：糖尿病，艾滋病毒/艾滋病和高血壓的既往史；將符合標(biāo)準(zhǔn)的36例患者納為觀察組。另外，選取同期來(lái)本科室就診的38例無(wú)結(jié)核病患者作為對(duì)照組，其中全部患者均無(wú)結(jié)核病，糖尿病或免疫功能低下癥的既往病史，也無(wú)近期發(fā)燒和/或持續(xù)咳嗽情況。對(duì)照組男、女比例為10∶9，年齡20～48歲，平均(30.14±10.76)歲；觀察組男、女比例為10∶8，年齡20～50歲，平均(34.35±10.57)歲；兩組患者一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 血樣采集和處理 分別于清晨8:00前通過(guò)靜脈穿刺收集兩組患者肝素化血液。

1.2.2 菌液培養(yǎng) 將本科室保藏MTB接種于酸性羅氏培養(yǎng)基，斜面朝上靜置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，每隔3 d觀察1次。長(zhǎng)出菌落后，轉(zhuǎn)接至MGIT960液體培養(yǎng)基(含MGIT雜菌抑制劑)中，A600達(dá)到0.8后待用。

1.2.3 中性粒細(xì)胞Fcγ受體表達(dá)檢測(cè) 采用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌細(xì)胞2次，并用于流式細(xì)胞術(shù)染色方案，通過(guò)使用小鼠單克隆抗人抗體CD32(克隆號(hào)FLI8.26，eBioscience)-別藻藍(lán)蛋白(APC)，CD64(克隆號(hào)10.1，eBioscience)-藻紅蛋白花青染色細(xì)胞來(lái)測(cè)定中性粒細(xì)胞Fcγ受體CD64和CD32表達(dá)。在加入抗體前加入MTB菌液(A600=0.8)30 μL，37 ℃孵育30 min，檢測(cè)CD64和CD32表達(dá)[6]。

1.2.4 TLRs表達(dá)檢測(cè) 分別取30 μL兩組患者肝素化血液，加入抗人TLR1-PE(克隆號(hào)GD2.F4，eBioscience)、TLR2-PE(克隆號(hào)T2.5，eBioscience)和TLR4-PE(克隆號(hào)：HTA125，eBioscience)單克隆抗體，孵育30 min后用PBS清洗1次，離心取上清后作為感染前待測(cè)樣。在加入抗體前加入MTB菌液(A600=0.8)30 μL，37 ℃孵育30 min，加入上述抗體重復(fù)相同操作后獲得MTB感染后待測(cè)液。通過(guò)QT-PCR檢測(cè)TLR1、TLR2和TLR4相對(duì)表達(dá)量[7]。見(jiàn)表1。

表1 PCR引物

1.2.5 中性粒細(xì)胞吞噬能力檢測(cè) 取100 μL肝素化血樣做好標(biāo)記，將5 nmol/L PMA(Sigma，USA)作為陽(yáng)性對(duì)照，向所有管內(nèi)加入預(yù)冷卻的FITC標(biāo)記大腸桿菌(A600=0.8)，加入100 μL猝滅溶液，然后洗滌，裂解并固定，將細(xì)胞懸浮液與染色溶液一起溫育，并在4 ℃下孵育10 min。使用藍(lán)綠激發(fā)光(488 nm氬離子激光)，通過(guò)FACS Calibur流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson，USA)分析細(xì)胞。在加入抗體前加入MTB菌液(A600=0.8)30 μL，37 ℃孵育30 min，再次通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)獲得感染后中性粒細(xì)胞吞噬能力結(jié)果[8]。

2 結(jié) 果

2.1 兩組感染前后中性粒細(xì)胞表達(dá)比較 兩組感染后CD64表達(dá)水平均明顯高于感染前,而且觀察組均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；對(duì)照組感染后CD32表達(dá)水平明顯提升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.2 兩組感染前后TLRs相對(duì)表達(dá)量比較 對(duì)照組感染前TLRs表達(dá)水平均明顯低于觀察組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；感染后兩組TLRs表達(dá)量均明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

2.3 兩組感染前后中性粒細(xì)胞吞噬能力比較 兩組感染前后中性粒細(xì)胞吞噬作用百分比均明顯變化，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；對(duì)照組感染前吞噬作用百分比明顯高于觀察組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，兩組感染后吞噬作用百分比比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3，圖2。

表2 兩組感染前后中性粒細(xì)胞表達(dá)比較

注：與對(duì)照組比較，#P<0.05

圖1 兩組感染前后TLRs相對(duì)表達(dá)量比較

組別n感染前感染后t1P1對(duì)照組3875.00±30.5097.76±4.154.558<0.05觀察組3650.50±15.3098.57±5.1317.873<0.05t24.3300.749P2<0.05>0.05

注：a為對(duì)照組；b為觀察組

圖2 兩組中性粒細(xì)胞吞噬能力比較

3 討 論

結(jié)核病活動(dòng)期患者可通過(guò)咳嗽、吐痰、說(shuō)話或者噴嚏在空氣中傳播MTB，使周?chē)说娜耸盏礁腥綶1,9]。篩選發(fā)病高危人群，早期發(fā)現(xiàn)并接種卡介苗(BCG)疫苗可避免疾病發(fā)生，對(duì)于可能患病的患者，需要長(zhǎng)期服用多種抗菌藥物進(jìn)行治療[10]。但抗菌藥物耐藥性是一個(gè)日益嚴(yán)重的問(wèn)題，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多重耐藥結(jié)核病(MDR-TB)和廣泛耐藥結(jié)核病(XDR-TB)發(fā)病率在不斷上升[11]。因此針對(duì)結(jié)核病治療和MTB抑制的研究非常必要，本研究針對(duì)MTB感染期間中性粒細(xì)胞及其受體、TLRs表達(dá)變化，中性粒細(xì)胞吞噬作用變化展開(kāi)研究。

研究表明，在結(jié)核感染期間病原體識(shí)別的初始階段，中性粒細(xì)胞提供顯著的免疫抗性，這表現(xiàn)為對(duì)病原體的吞噬作用、細(xì)胞凋亡和下游免疫反應(yīng)的激活等[12]。在吞噬作用中Fcγ受體起重要作用，它們?cè)谒型淌杉?xì)胞上表達(dá)。在本研究中，觀察兩組感染后各項(xiàng)指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，CD64表達(dá)水平均明顯高于感染前和同時(shí)間段對(duì)照組，說(shuō)明結(jié)核病患者外周血中Fcγ受體明顯高于對(duì)照組，該受體增加量明顯高于感染MTB者，說(shuō)明Fcγ受體是參與抗原吞噬作用和相關(guān)功能調(diào)節(jié)。因此，CD64的表達(dá)水平用作診斷結(jié)核病的額外標(biāo)志物具有相當(dāng)重要的意義。

在結(jié)核病中，除中性粒細(xì)胞Fcγ受體外，TLRs也被認(rèn)為在MTB識(shí)別中起著至關(guān)重要的作用。已有報(bào)道顯示，結(jié)核病患者血液中的中性粒細(xì)胞通過(guò)TLR2識(shí)別MTB[13]。在研究中觀察到MTB感染的中性粒細(xì)胞中TLR2的表達(dá)增加，概述了中性粒細(xì)胞TLR2對(duì)MTB菌株的識(shí)別和響應(yīng)。同時(shí)，有研究表明當(dāng)TLR4被阻斷時(shí)， BCG感染的CXCL8產(chǎn)生顯著減少[14-15]。在本研究中也觀察到了類(lèi)似的變化，感染后TLRs表達(dá)量均明顯上升，說(shuō)明TLRs表達(dá)受MTB菌株的影響。在實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，感染MTB時(shí)結(jié)核病患者血液中TLRs表達(dá)明顯高于對(duì)照組，說(shuō)明中性粒細(xì)胞在進(jìn)一步感染MTB后能夠快速進(jìn)行TLRs介導(dǎo)的活化反應(yīng)。對(duì)比外周血中中性粒細(xì)胞吞噬大腸桿菌能力發(fā)現(xiàn)，感染前對(duì)照組吞噬作用百分比明顯高于觀察組，表明中性粒細(xì)胞由于MTB感染而經(jīng)歷功能惡化。

雖然研究者強(qiáng)調(diào)了中性粒細(xì)胞在結(jié)核病中診斷的重要性，就目前觀察還可進(jìn)行深入。下一步可以對(duì)TLRs受Fcγ刺激后吞噬作用及其導(dǎo)致的下游信號(hào)變化展開(kāi)研究，進(jìn)一步了解結(jié)核病期間中性粒細(xì)胞間修飾為中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的診斷、藥物設(shè)計(jì)和治療打下基礎(chǔ)。

總而言之，結(jié)核病感染期間，患者外周血中性粒細(xì)胞CD64、TLR2和TLR4表達(dá)水平均明顯升高，且中性粒細(xì)胞吞噬功能下降明顯。