杜利君，張 兵，李 欣，楊 波，邢 晏

(1.南充市中心醫(yī)院/川北醫(yī)學(xué)院第二臨床學(xué)院檢驗(yàn)科，四川南充 637000；2.西華師范大學(xué)數(shù)學(xué)與信息學(xué)院,四川南充 637000)

結(jié)核病是一種由結(jié)核分枝桿菌(MTB)感染引起的傳染病，嚴(yán)重危害著人類的生命健康。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)2017年全球結(jié)核病報(bào)告顯示，2016年全球結(jié)核病發(fā)病的人數(shù)為1 040萬(wàn),中國(guó)是全球30個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一[1]。此外，在我國(guó)甲、乙類傳染病病死率中，肺結(jié)核排名第2位，其實(shí)驗(yàn)室診斷率不足40%[2]。由于結(jié)核病的診斷較為復(fù)雜，既往的細(xì)菌病原體檢測(cè)、結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)(TST)、抗結(jié)核抗體檢測(cè)及影像學(xué)檢查等診斷方法遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床需求[3]。經(jīng)過不斷地研究，以T淋巴細(xì)胞免疫為基礎(chǔ)的體外γ-干擾素釋放試驗(yàn)(IGRAs) 近年來(lái)在臨床得到廣泛應(yīng)用。IGRAs檢測(cè)的基本原理是MTB特異性抗原-早期分泌抗原6(ESAT-6)和培養(yǎng)濾液蛋白10(CFP-10)在體外刺激全血中的T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生γ干擾素(IFN-γ)，通過酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定實(shí)驗(yàn)法(ELISA)測(cè)定 IFN-γ水平來(lái)判斷受檢者是否感染MTB。雖然IGRAs已成為國(guó)內(nèi)外結(jié)核診療指南推薦的重要實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法[4-5]，是臨床診斷結(jié)核病的重要輔助手段，但在檢測(cè)過程中，除了有陰性結(jié)果、陽(yáng)性結(jié)果外，還會(huì)產(chǎn)生一定比例的不確定結(jié)果(ITRs)[6]。不確定結(jié)果不能反映患者的結(jié)核感染狀況，可能引起臨床醫(yī)生診斷MTB感染的混亂及正確解釋IGRAs不確定結(jié)果的困難；此外，在檢測(cè)過程中一旦遇到不確定結(jié)果，實(shí)驗(yàn)室將重新采集標(biāo)本復(fù)查，延誤報(bào)告時(shí)間及增加檢測(cè)成本。因此，本文通過回顧2014年7月至2018年7月在本院檢測(cè)的可疑結(jié)核感染患者或需排除結(jié)核感染患者的IGRAs，分析不確定結(jié)果發(fā)生的比率及原因，為臨床了解IGRAs不確定結(jié)果可能發(fā)生的疾病因素及正確解釋IGRAs不確定結(jié)果報(bào)告提供依據(jù)和思路，同時(shí)為優(yōu)化試劑盒性能、提高IGRAs檢測(cè)的可靠性和準(zhǔn)確性奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧2014年7月至2018年7月在本院1 781例可疑結(jié)核感染患者或需排除結(jié)核感染患者的IGRAs檢測(cè)結(jié)果，年齡為(48.23±19.84)歲，其中男1 139例，女642例。按不同年齡分為3組，<18歲組163例，18～65歲組1 100例，≥65歲組518例。

1.2 儀器與試劑 IGRAs試劑盒(北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)股份有限公司)，恒溫培養(yǎng)箱(上海博迅公司)，Mutiskan FC酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(賽默飛世爾儀器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 IGRAs試驗(yàn) 嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作。采集4 mL肝素鋰抗凝靜脈全血，2 h之內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室。按每管1 mL全血分裝至本底對(duì)照培養(yǎng)管(N管)、測(cè)試培養(yǎng)管(T管) 、陽(yáng)性對(duì)照培養(yǎng)管(P管)，輕柔顛倒混勻5次后，將培養(yǎng)管直立于37 ℃恒溫箱中，溫育22～24 h。將培養(yǎng)后的培養(yǎng)管以3 000 r/min，離心10 min，通過ELISA檢測(cè)上清液中的γ-干擾素(IFN-γ)水平，酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定其吸光度A，根據(jù)試劑盒中校準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算IFN-γ水平。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制 由6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度A值與相應(yīng)濃度計(jì)算得出的相關(guān)系數(shù)(r)≥0.99； 400 pg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液的平均吸光度A值<1.0。

1.3.3 判斷標(biāo)準(zhǔn) 所得不確定結(jié)果均需重新采集樣本復(fù)查，以排除實(shí)驗(yàn)因素引起不確定結(jié)果，復(fù)查后仍為不確定，則判定為不確定結(jié)果，見表1。

表1 IGRAs檢測(cè)結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)(pg/mL)

注：n=本底對(duì)照培養(yǎng)管(N管)、T=測(cè)試培養(yǎng)管(T管)、P=陽(yáng)性對(duì)照培養(yǎng)管(P管)

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 回顧2014年7月至2018年7月例患者的IGRAs檢測(cè)結(jié)果，用Excel 2007軟件建立數(shù)據(jù)庫(kù)，用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料用百分率表示，組間比較用χ2檢驗(yàn)，采用二元Logistic回歸進(jìn)行單因素與不確定結(jié)果的分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 IGRAs的檢測(cè)結(jié)果 1 781例IGRAs檢測(cè)樣本，陽(yáng)性569例(31.95%)，陰性1 151例(64.63%)，不確定結(jié)果61例(3.43%)。

2.2 不同性別患者IGRAs的檢測(cè)結(jié)果比較 1 781例IGRAs檢測(cè)樣本中，男性1 139例，女性642例，男性陽(yáng)性率為33.45%，女性陽(yáng)性率為29.28%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.208，P=0.075)；男、女患者ITRs分別為3.34%，3.58%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.073，P=0.784)，見表2。

表2 不同性別患者IGRAs的檢測(cè)結(jié)果比較[n(%)]

2.3 不同年齡組的IGRAs的檢測(cè)結(jié)果比較 1 781例IGRAs檢測(cè)樣本中，<18歲組的患者IGRAs陽(yáng)性率明顯低于18～65歲組和≥65歲組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=28.448,P=0.000)；與18～65歲組比較，<18歲組和≥65歲組ITRs發(fā)生率較高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2值分別為10.584、9.015；P=0.001、0.003)。<18歲組和≥65歲組ITRs發(fā)生率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.722，P=0.396)，見表3。

表3 不同年齡組的IGRAs的檢測(cè)結(jié)果比較[n(%)]

2.4 檢測(cè)IGRAs的確診疾病類型與ITRs的關(guān)系 對(duì)61例可疑結(jié)核感染患者IGRAs的ITRs標(biāo)本進(jìn)行回訪，剔除4例資料不全患者，經(jīng)二元logistic回歸分析，自身免疫性疾病(OR為2.84;95%CI為1.50～5.39;P=0.001)、HIV感染患者(OR為3.04;95%CI為 1.26～7.35;P=0.013)的ITRs與確定結(jié)果(陰性/陽(yáng)性)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

表4 檢測(cè)IGRAs的確診疾病類型與ITRs的關(guān)系

注：與陰性/陽(yáng)性確定結(jié)果比較，*P<0.05

3 討 論

目前，大量研究評(píng)估了IGRAs在疑似結(jié)核病患者診斷中的臨床應(yīng)用價(jià)值[7-8]，而較少研究IGRAs檢測(cè)中出現(xiàn)的不確定結(jié)果。DIEL等[9]研究顯示，IGRAs的不確定結(jié)果發(fā)生率在3%～21%，不確定的結(jié)果可能限制IGRAs使用的有效性，影響結(jié)核病的診斷和治療。因此，除了關(guān)注IGRAs檢測(cè)的陰性或陽(yáng)性結(jié)果之外，還應(yīng)重視IGRAs不確定結(jié)果發(fā)生的比例和原因，為臨床疾病的診斷和治療提供幫助。

本研究顯示臨床懷疑或者需排除結(jié)核感染的患者檢測(cè)IGRAs的不確定結(jié)果發(fā)生率為3.43%，與TEBRUEGGE等[10]研究基本一致，不確定結(jié)果主要在患有慢性疾病如風(fēng)濕性疾病[11]或免疫功能低下[12]的患者中出現(xiàn)，而產(chǎn)生不確定結(jié)果的潛在性因素可能主要是由于陽(yáng)性對(duì)照管弱應(yīng)答植物血凝素(PHA)的刺激，產(chǎn)生低水平的IFN-γ；或者少量患者出現(xiàn)無(wú)PHA刺激的本底對(duì)照管的高水平IFN-γ背景[13-14]。本研究顯示，不確定結(jié)果在<18歲組與≥65歲組發(fā)生率較高，而在18～65歲組較低，提示免疫功能是否完善在IGRAs的不確定結(jié)果發(fā)生中具有重要作用，兒童青少年免疫功能尚處在發(fā)育階段，老年人免疫功能逐漸衰老，年齡可能是PHA誘導(dǎo)IFN-γ應(yīng)答高低的關(guān)鍵因素，使用年齡特異性的陽(yáng)性對(duì)照截?cái)嘀?，或摻入另一種產(chǎn)生相似的陽(yáng)性對(duì)照刺激物，可能提高IGRAs試劑盒在兒童青少年和老年人群中的檢測(cè)性能，降低不確定結(jié)果的發(fā)生率[10]。此外，本文未發(fā)現(xiàn)性別與IGRAs的不確定結(jié)果發(fā)生率的差異，在關(guān)于性別與不確定結(jié)果的關(guān)系研究中，研究的結(jié)論并不一致，BEFFA等[15]通過對(duì)1 429例患者如有結(jié)核接觸史、或TST(+)、或結(jié)核病、或可疑結(jié)核患者進(jìn)行分析，認(rèn)為性別與不確定結(jié)果的發(fā)生無(wú)關(guān)；而JUNG等[16]通過對(duì)631例風(fēng)濕疾病患者的研究，發(fā)現(xiàn)女性與IGRAs不確定結(jié)果發(fā)生更為密切，性別與不確定結(jié)果關(guān)系研究結(jié)論不一致可能與納入研究對(duì)象的疾病類型、樣本數(shù)量、種族、地理來(lái)源、卡介苗接種史和伴隨免疫抑制劑的標(biāo)準(zhǔn)治療使用有著密切的關(guān)系[17]。

免疫功能低下或機(jī)體長(zhǎng)期處于慢性炎癥的作用下，可能增加活動(dòng)性結(jié)核病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[18]，患者的IGRAs不確定結(jié)果與免疫功能低下和慢性炎癥密切相關(guān)[19-20]。因此，進(jìn)一步回顧分析了1 781例患者的疾病種類，以判斷不確定結(jié)果發(fā)生的危險(xiǎn)因素，結(jié)果顯示自身免疫性疾病、HIV感染患者的不確定結(jié)果與確定結(jié)果(陰性/陽(yáng)性)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示不確定結(jié)果的發(fā)生可能與自身免疫性疾病、HIV感染患者關(guān)系密切。在自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制中，發(fā)揮關(guān)鍵作用的TH17炎癥通路下調(diào)了由Th1途徑產(chǎn)生的IFN-γ水平，此外，在治療過程中使用免疫抑制劑、導(dǎo)致免疫功能低下、使全血中的T淋巴細(xì)胞體外低應(yīng)答PHA的刺激，陽(yáng)性對(duì)照管產(chǎn)生較低水平的IFN-γ[20]。 HIV感染患者不確定結(jié)果的發(fā)生可能與HIV病毒感染攻擊CD4+T細(xì)胞，使T細(xì)胞功能喪失，導(dǎo)致低應(yīng)答PHA刺激有關(guān)，值得注意的是，在中晚期免疫缺陷患者中，不確定的IGRAs結(jié)果將增加嚴(yán)重臨床事件發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。此外，研究者未發(fā)現(xiàn)不確定結(jié)果與慢性炎癥組的關(guān)系，可能與本次研究納入的樣本量較小有關(guān)。

本研究屬于回顧性研究，存在一定的局限性。未評(píng)估不確定結(jié)果與臨床免疫抑制劑的使用情況，與反映免疫功能的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的關(guān)系，如淋巴細(xì)胞數(shù)量、清蛋白水平、CD4+細(xì)胞計(jì)數(shù)等，以及未評(píng)估其他可能影響不確定結(jié)果的檢測(cè)因素，如標(biāo)本采集及處理時(shí)間、標(biāo)本送檢的季節(jié)和溫度，及技術(shù)錯(cuò)誤等。

綜上所述，通過回顧分析本院檢測(cè)的可疑結(jié)核感染患者或需排除結(jié)核感染患者IGRAs的不確定結(jié)果發(fā)生的比率及原因，發(fā)現(xiàn)不確定結(jié)果發(fā)生不僅與年齡因素關(guān)系密切，還與患者的免疫功能狀態(tài)或免疫抑制劑的使用密切相關(guān)。