張 軒，王 淏，羅燕芬，李有強(qiáng)△

(1.廣東省中醫(yī)院/廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東廣州 510120； 2.廣州血液中心檢驗(yàn)科，廣東廣州 510095)

銅綠假單胞菌是醫(yī)院常見的條件致病菌，常感染癌癥、嚴(yán)重皮膚燒傷、囊性肺纖維化及各種免疫力低下患者[1]。3-O-C12-HSL是銅綠假單胞菌重要的毒力分子之一，可調(diào)節(jié)銅綠假單胞菌的耐藥和宿主的免疫功能，介導(dǎo)免疫逃逸[2-3]。長鏈非編碼RNA(LncRNA)是長度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，可調(diào)控基因的表達(dá)，涉及的調(diào)控層面包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控，翻譯水平調(diào)控和表觀遺傳調(diào)控，調(diào)控方式包括染色體修飾、轉(zhuǎn)錄激活或干擾等[4]。有研究表明[5]，從單核細(xì)胞分化為單核細(xì)胞源性樹突狀細(xì)胞(Mo-DCs)過程中，LncRNA表達(dá)譜出現(xiàn)了明顯差異，LncRNA Lnc-DC被發(fā)現(xiàn)可與轉(zhuǎn)錄因子STAT3結(jié)合，阻礙SHP1介導(dǎo)的去磷酸化作用，從而調(diào)控Mo-DCs的分化。前期研究發(fā)現(xiàn)3-O-C12-HSL 在阻礙Mo-DCs 成熟過程中LncRNA的表達(dá)譜也出現(xiàn)了明顯差異。本文以長鏈非編碼RNA RP11-367F23.2為切入點(diǎn)，研究3-O-C12-HSL是否抑制Mo-DCs表達(dá)RP11-367F23.2，該抑制作用是否經(jīng)過氧化物酶增殖物激活受體γ(PPARγ)介導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料 RPMI 1640和胎牛血清(Life公司)；脂多糖(LPS)、3-O-C12-HSL和GW9662(Sigma公司)；人淋巴細(xì)胞分離液Ficoll(Axis-shield公司)；磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、二甲基亞砜(DMSO)和Trizol(invitrogen公司)；FITC-CD14(eBioscience公司)；抗人CD14磁珠(BD公司)；人白細(xì)胞介素-4(hIL-4)和人粒單核細(xì)胞集落刺激因子(hGM-CSF)和PPARγ(Peprotech公司)；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser和SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(TAKARA公司)； ABI Viia7高產(chǎn)率熒光定量聚合酶聯(lián)反應(yīng)(PCR)儀(美國ABI公司)。

1.2 方法

1.2.1 Mo-DCs分離和培養(yǎng) 選取健康人外周血50 mL，加入等量的PBS混勻后，加入到100 mL人淋巴細(xì)胞分離液上面，密度梯度離心法獲得單個(gè)核細(xì)胞。PBS洗滌后用CD14磁珠分選CD14+單核細(xì)胞，加入完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基、終濃度500 U/mL的hIL-4和500 U/mL的hGM-CSF)，細(xì)胞密度為1×106/mL。3 d后半量換液，5 d后獲得Mo-DCs。

1.2.2 Mo-DCs的分組和處理 將Mo-DCs細(xì)胞分為4組：LPS組為模型組，加入0.1 μg/mL LPS；3-O-C12-HSL組為實(shí)驗(yàn)組1，加入終濃度為25 μmol/L的3-O-C12-HSL(同時(shí)加入0.1 μg/mL LPS)；GW9662組為實(shí)驗(yàn)組2，加入終濃度為10 μmol/L GW9662，GW9662處理30 min后分別加入3-O-C12-HSL和 LPS；PBS組為對照組，加入等體積的含有0.1%DMSO的PBS。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。18 h后收集細(xì)胞。3-O-C12-HSL為脂溶性小分子物質(zhì)(MW 282道爾頓)，無免疫原性，需要在LPS等完全抗原活化免疫細(xì)胞后才能發(fā)揮作用。因此，本實(shí)驗(yàn)過程中3-O-C12-HSL需和LPS同時(shí)添加。

1.2.3 熒光定量PCR檢測RP11-367F23.2 提取細(xì)胞RNA，按照試劑盒操作說明將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，對RP11-367F23.2進(jìn)行定量測定。RP11-367F23.2正向引物為5′-TCA GCC ACC TCC ACT CTT TT-3′，反向引物為5′-CCC AGC TTT TCC TGA CTC TG-3′，引物由invitrogen公司合成。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

處理細(xì)胞18 h后，RP11-367F23.2在4組相對表達(dá)量：PBS組(1.000±0.058)、LPS組(5.200±0.374)、3-O-C12-HSL組(2.995±0.347)；GW9662組(5.900±0.473)；LPS組與PBS組RP11-367F23.2表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000 4<0.05)；3-O-C12-HSL組與LPS組RP11-367F23.2表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.011<0.05)；GW9662組與3-O-C12-HSL組RP11-367F23.2表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000 8<0.05)，各組長鏈非編碼RNA RP11-367F23.2表達(dá)量的變化見圖1。

注：與LPS組比較，*P<0.05；與3-O-C12-HSL組比較，#P<0.05；與GW9662組比較，△P<0.05

圖1 各組RP11-367F23.2分泌情況

3 討 論

樹突狀細(xì)胞(DC)是人體專職抗原遞呈細(xì)胞(APC)，能攝取、加工及提呈抗原，是啟動(dòng)、調(diào)控、維持Th細(xì)胞免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)[6]。DC的分化和成熟狀態(tài)對免疫應(yīng)答反應(yīng)起著重要的作用[7]。前期研究發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌分泌的信號(hào)分子3-O-C12-HSL能夠通過作用于Mo-DCs，促進(jìn)CD4+T細(xì)胞向Th2方向極性分化，參與免疫逃逸[2-3]。

LncRNA是長度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，在真核細(xì)胞中普遍表達(dá)，隨著芯片和測序技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的LncRNA被發(fā)現(xiàn)在多種層面上調(diào)控基因的表達(dá)水平，在細(xì)胞增殖分化和細(xì)胞周期等眾多生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用[8-9]。本課題組前期用LncRNA芯片技術(shù)篩選出3-O-C12-HSL 阻礙Mo-DCs 成熟過程中有差異性表達(dá)的基因[10]，本文從表達(dá)差異5倍以上LncRNA中選擇了一條RP11-367F23.2作為候選LncRNA。RP11-367F23.2位于9號(hào)染色體長臂上，長約4 818 bp，目前國內(nèi)外均未見有關(guān)RP11-367F23.2的相關(guān)報(bào)道。LncRNA被發(fā)現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞、干細(xì)胞和突觸細(xì)胞等多種細(xì)胞的分化成熟起到調(diào)控作用[11-12]，但對其在免疫細(xì)胞分化成熟中的作用研究的還比較少，對于這些LncRNA參與的宿主防御機(jī)制還沒有完全清楚。因此，研究3-O-C12-HSL是否抑制Mo-DCs表達(dá)RP11-367F23.2，該抑制作用是否通過PPARγ介導(dǎo)，對豐富長鏈非編碼RNA在免疫反應(yīng)中的生物學(xué)功能及病理生理過程具有重要意義。

PPARγ在人體多種免疫細(xì)胞中都有表達(dá)，如DC、脂肪細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等。PPARγ是一類核受體，由N末端的DNA結(jié)合區(qū)和C末端的配體結(jié)合區(qū)組成，通過與配體結(jié)合而被激活。激活后的PPARγ發(fā)揮抗炎作用，可使腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和白細(xì)胞介素-6(IL-6)等促炎因子表達(dá)減少。PPARγ可影響絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路，將受體傳遞的信息傳入細(xì)胞核內(nèi)，從而調(diào)控基因的表達(dá)、細(xì)胞的增殖分化和死亡[13]。GW9662是PPARγ的不可逆性拮抗劑，可以使PPARγ配體結(jié)合區(qū)第285號(hào)半胱氨酸殘基芳香化，從而阻礙PPARγ與其他配體的結(jié)合。GW9662被廣泛地應(yīng)用于抑制PPARγ的活性[14-15]。

本課題組研究發(fā)現(xiàn)，LPS誘導(dǎo)的Mo-DCs與單核細(xì)胞相比，RP11-367F23.2顯著升高，說明RP11-367F23.2參與了Mo-DCs的成熟過程，與炎性反應(yīng)相關(guān)。Mo-DCs經(jīng)3-O-C12-HSL刺激后，RP11-367F23.2表達(dá)量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Mo-DCs經(jīng)GW9662處理后再加入3-O-C12-HSL，細(xì)胞中的RP11-367F23.2表達(dá)又顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示3-O-C12-HSL通過PPARγ拮抗Mo-DCs表達(dá)RP11-367F23.2。

4 結(jié) 論

本文證實(shí)了3-O-C12-HSL通過PPARγ拮抗Mo-DCs表達(dá)RP11-367F23.2，為深入研究LncRNA的生物學(xué)功能及其與疾病的關(guān)系提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，進(jìn)一步豐富了銅綠假單胞菌的致病機(jī)理，可為臨床提供新的思路和應(yīng)對策略。