田雙雙，王俊美，崔云東，張禮濤

鼻咽癌是一種惡性的上皮細(xì)胞腫瘤。在世界范圍內(nèi)，我國(guó)鼻咽癌的發(fā)病率和病死率是最高的。鼻咽癌通常具有侵襲和轉(zhuǎn)移的特性，而這一特性卻導(dǎo)致許多鼻咽癌病人死亡[1]。研究發(fā)現(xiàn)，95%的鼻咽癌在早期就發(fā)生了腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[2]。因此，鼻咽癌侵襲相關(guān)因子的研究，成了治療該病的重中之重。但是目前關(guān)于鼻咽癌的侵襲相關(guān)因子還未見(jiàn)明確報(bào)道。

Rho相關(guān)卷曲螺旋蛋白激酶(Rho-associated coiled coil-containing protein kinase,ROCK)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是RhoA的下游效應(yīng)蛋白。文獻(xiàn)報(bào)道，ROCK有兩種異構(gòu)體，分別是ROCK1和ROCK2，其中ROCK1蛋白具有調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重組和細(xì)胞粘附等作用，ROCK1的調(diào)節(jié)作用，使其具有調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞遷移的功能[3]。

雖然ROCK1在諸多癌癥中被研究，但其與鼻咽癌的相關(guān)性并沒(méi)有去闡述。這個(gè)研究，將收集鼻咽癌住院病人30例，并收集同期住院的鼻咽癌病人的癌旁組織作為對(duì)照，通過(guò)免疫組織化學(xué)法和蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)，分析鼻咽癌中，ROCK1的表達(dá)情況；然后使用ROCK的抑制劑Y-27632處理鼻咽癌細(xì)胞株6-10B，來(lái)揭示ROCK1與鼻咽癌細(xì)胞侵襲的關(guān)系，以此來(lái)評(píng)估鼻咽癌中ROCK1的臨床學(xué)意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 于2016年1—12月，在臨沂市河?xùn)|區(qū)人民醫(yī)院收集30例鼻咽癌病人病理組織，同期收集30例鼻咽癌的癌旁組織。所選標(biāo)本都由該院兩個(gè)病理科同事，進(jìn)行雙盲病理學(xué)檢查確診，這些標(biāo)本都未進(jìn)行化療治療。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求，并且所選病人均簽署知情同意書(shū)。

1.2 主要儀器與試劑 二氧化碳培養(yǎng)箱(型號(hào)371)購(gòu)自Thermo公司；移液器、高速低溫離心機(jī)(型號(hào)5810R)購(gòu)自eppendorf公司；超低溫冰箱(型號(hào)MDF-192)購(gòu)自SANYO公司；垂直電泳儀購(gòu)自BioRad公司；免疫組化試劑盒、BCA protein assay kit(P0010)購(gòu)自碧云天生物試劑公司；ROCK1抗體(#4035)購(gòu)自Cell Sinnalling Technology公司；β-actin(BM0627)、二抗(BM2002)購(gòu)自博士德公司。

1.3 免疫組織化學(xué) 將病理組織進(jìn)行石蠟包埋，石蠟包埋后，進(jìn)行切片，厚度為4 μm，將切片置于載玻片上，放在60 ℃烘片機(jī)上烘烤1 h；再置于二甲苯I中浸泡5 min，二甲苯Ⅱ中浸泡5 min；乙醇梯度水化；然后在蒸餾水中浸泡2 min；進(jìn)行檸檬酸鹽抗原修復(fù)，將玻片置于室溫自然冷卻后。毎張切片滴50 μL，3%過(guò)氧化氫，室溫30 min，PBS洗3次，每次5 min；每張切片使用50 μL 10%山羊血清進(jìn)行封閉，室溫封閉30 min；每張切片滴加ROCK1抗體，37 ℃，2 h；PBS沖洗3次，每次3min；滴加二抗，室溫30 min；PBS沖洗3次，每次3min；再滴加鏈霉素康生物素蛋白-過(guò)氧化酶，室溫30 min；PBS沖洗3次，每次3min；用新鮮配制的DAB顯色3min，在顯微鏡下掌握染色程度，自來(lái)水沖洗終止染色；PBS沖洗3次，每次3min；蘇木素復(fù)染，自來(lái)水沖洗后1%鹽酸分化，自來(lái)水沖洗5 min；梯度脫水，切片烤干，中性樹(shù)膠封片，閱片。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) 鼻咽癌細(xì)胞株6-10B培養(yǎng)在RPMI1640(含有10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)培養(yǎng)基中。永生化鼻咽上皮細(xì)胞株NP69培養(yǎng)在KMSF培養(yǎng)基中。將細(xì)胞株置于37 ℃、5%二氧化碳的全濕環(huán)境下，進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到融合度為80%左右時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)。在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)處理。

1.5 藥物處理 對(duì)鼻咽癌細(xì)胞株6-10B進(jìn)行ROCK1抑制劑(Y-27632)的處理。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，將Y-27632加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中，分別設(shè)兩個(gè)濃度進(jìn)行培養(yǎng)，10 μM和30 μM，在藥物處理1 h后，收集細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6 Western Blot 使用含有1%苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA蛋白裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白；使用BCA法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。然后制備10%的SDS-PAGE凝膠，將蛋白加入上樣Buffer后，加入孔中，進(jìn)行垂直電泳，之后在全濕環(huán)境下，轉(zhuǎn)膜(PVDF膜)，使用5%的牛血清白蛋白(BSA)進(jìn)行封閉，加入ROCK1抗體進(jìn)行4℃，過(guò)夜孵育。第2天PBS洗3次，每次5 min，再進(jìn)行HRP-二抗孵育2 h，PBS洗3次，每次5 min，最后進(jìn)行ECL發(fā)光液處理，暗室曝光。

1.7 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 在Transwell小室的提籃底部鋪上ECMatrix膠，然后在里面加入PRMI1640培養(yǎng)基，置于37 ℃培養(yǎng)箱中。在Transwell小室的下室中加入含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，上室加入不含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，每孔加入一定濃度的細(xì)胞懸液，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行染色，空氣中干燥。

2 結(jié)果

2.1 臨床標(biāo)本中ROCK1的表達(dá)升高 在臨床組織標(biāo)本中，使用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)ROCK1在鼻咽癌組織中的表達(dá)情況(圖1)。圖中棕褐色為ROCK1陽(yáng)性表達(dá)，藍(lán)色部分為ROCK1的陰性表達(dá)，觀察結(jié)果顯示，30例鼻咽癌組織中，有18例陽(yáng)性，12例陰性；而對(duì)照組中只有2例陽(yáng)性。說(shuō)明鼻咽癌組中ROCK1的表達(dá)明顯高于對(duì)照組(χ2=19.20,P<0.000 1)。

2.2 細(xì)胞株中ROCK1的表達(dá) 為了揭示鼻咽癌中ROCK1的表達(dá)情況，使用了鼻咽癌細(xì)胞株6-10B和永生化鼻咽上皮細(xì)胞株NP69，通過(guò)Western Blot方法，檢測(cè)在細(xì)胞株中ROCK1的表達(dá)情況，如圖2所示，與對(duì)照組(NP69)(0.43±0.08)相比，鼻咽癌組(6-10B)細(xì)胞中的ROCK1的表達(dá)(1.25±0.23)明顯升高(t=3.187，P=0.033)。

圖2 ROCK1在鼻咽癌組(6-10B)和對(duì)照組(NP69)細(xì)胞株中的表達(dá)

2.3 藥物處理后6-10B中ROCK1表達(dá) 對(duì)鼻咽癌細(xì)胞株6-10B進(jìn)行藥物處理后，通過(guò)Western Blot方法，檢測(cè)在細(xì)胞株中ROCK1的表達(dá)情況。如圖3所示，未處理為(2.6±0.54)，10 μM Y-27632處理為(1.2±0.78)，30 μM Y-27632處理為(0.73±0.12)。隨著Y-27632的濃度增加，ROCK1的表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.76，P=0.04)。

圖3 Y-27632處理前后ROCK1的表達(dá)：1為未處理；2為10 μM Y-27632處理；3為30 μM Y-27632處理

2.4 Transwell小室檢測(cè)藥物處理前后細(xì)胞侵襲能力 以6-10B未處理組作為對(duì)照組，Y-27632的10 μM和30 μM為實(shí)驗(yàn)組，通過(guò)Transwell小室實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)Y-27632處理前后細(xì)胞的侵襲能力。在560 nm處記錄數(shù)值，三個(gè)組的數(shù)據(jù)為(171.67±17.89)、(120±19.07)和(67.33±13.58)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=29.65，P=0.0008)。

注：a表示與1相比，t=3.45，P=0.025；b表示與1相比，t=8.40，P=0.001 1圖4 Y-27632處理前后6-10B細(xì)胞的侵襲能力：1為未處理；2為10 μM Y-27632處理；3為30 μM Y-27632處理

3 討論

鼻咽癌是一種異質(zhì)性實(shí)體瘤，我國(guó)為鼻咽癌高發(fā)區(qū)，尤其是華南和香港等地區(qū)[4-5]。在2010年，報(bào)道顯示，在我國(guó)華南地區(qū)鼻咽癌的發(fā)病率和死亡率均為19.5%，包括香港在內(nèi)，每10萬(wàn)人有7.7人高發(fā)鼻咽癌[6]。目前關(guān)于鼻咽癌的病因，大致總結(jié)為：遺傳成分，如染色體1、3、9、11、12和14的畸變；感染因素，如Epstein Barr病毒(EBV)和環(huán)境因素等。根據(jù)WHO分類(lèi)，鼻咽癌的病理類(lèi)型分為角化性鱗狀細(xì)胞癌(I型，稱(chēng)為高分化)，分化鼻咽非角化性癌(Ⅱ型，稱(chēng)為中度分化)，未分化癌(Ⅲ型，稱(chēng)為低分化)[7]。事實(shí)上，在上述發(fā)病率高的地區(qū)，至少有95%的鼻咽癌病人是低分化的病理類(lèi)型[8]。目前放療和化療是鼻咽癌的主要治療手段[9]。但不幸的是，大約有20%的鼻咽癌病人在治療后仍有局部復(fù)發(fā)[10-11]。在鼻咽癌復(fù)發(fā)因素中，鼻咽癌的細(xì)胞侵襲性，被認(rèn)為起到了重要的作用。

ROCK1蛋白在細(xì)胞骨架蛋白重排和細(xì)胞粘附上，具有重要作用。有文獻(xiàn)報(bào)道，ROCK1蛋白在乳腺癌、肺癌及肝癌中都有高表達(dá)[3]。在本研究中，我們使用臨床標(biāo)本和細(xì)胞株發(fā)現(xiàn)，ROCK1在實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)均明顯高于對(duì)照組，提示ROCK1蛋白與鼻咽癌的發(fā)生存在相關(guān)性，這與我們及其他研究者[12]在其他實(shí)體瘤中的報(bào)道相一致。先前研究表明，ROCK1的高表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲[13-14]。Rho/ROCK信號(hào)通路是細(xì)胞侵襲的重要機(jī)制之一[15-16]。當(dāng)Rho GTP結(jié)合ROCK蛋白后，ROCK蛋白構(gòu)象發(fā)生了改變，將其催化結(jié)構(gòu)域充分暴露了出來(lái)，從而使ROCK可以激活下游效應(yīng)分子[17]。在前列腺癌和其他惡性腫瘤中，研究者均發(fā)現(xiàn)，ROCK1在促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中，起到了非常重要的作用[18]。在本研究中，我們也發(fā)現(xiàn)，在鼻咽癌細(xì)胞株6-10B中，使用Y-27632去抑制ROCK1的表達(dá)，隨著抑制劑濃度的增加，鼻咽癌細(xì)胞株的細(xì)胞侵襲性減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示ROCK1蛋白與鼻咽癌的侵襲性相關(guān)。

總之，本研究的結(jié)果表明，ROCK1基因在鼻咽癌組織和細(xì)胞株中均高表達(dá)，揭示ROCK1與鼻咽癌的發(fā)展相關(guān)。本研究為今后的臨床治療和靶標(biāo)藥物的開(kāi)發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。

圖1 ROCK1在鼻咽癌和癌旁組織的表達(dá)：A為鼻咽癌組織，B為癌旁組織(免疫組織化學(xué)染色×100)