張娟娟，張春蓮，張志軍，王超云

上皮性卵巢癌(Epithelial ovarian cancer,EOC)是婦科常見惡性腫瘤，國內(nèi)報(bào)道顯示其發(fā)病率及病死率均呈上升趨勢[1-2]。由于該疾病起病隱匿，早期癥狀不典型，多數(shù)病人確診時(shí)已為晚期，即便接受標(biāo)準(zhǔn)化的治療方案，病人預(yù)后仍不理想[3]。早期預(yù)測病人預(yù)后，制定針對性的治療方案，有助于改善病人結(jié)局[4]。腫瘤干細(xì)胞是腫瘤組織中具備自我更新、無限增殖、成瘤能力強(qiáng)，且可影響腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及抗放化療的細(xì)胞[5]；上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)可使腫瘤細(xì)胞擺脫細(xì)胞間粘附，從而提升其侵襲能力[6]。CD133蛋白是腫瘤干細(xì)胞重要標(biāo)志物，Snail、E-cadherin蛋白是反應(yīng)EMT的重要標(biāo)志物，已有研究證實(shí)上述蛋白與EOC病人預(yù)后具有一定的相關(guān)性[7-8]，但目前尚缺乏能夠具體預(yù)測病人術(shù)后生存情況的模型。因此，本研究利用Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型、R語言構(gòu)建病人術(shù)后生存情況的列線圖模型，有助于解決上述問題，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 納入2009年1月至2012年1月于十堰市太和醫(yī)院接受治療的152例EOC病人為對象，進(jìn)行持續(xù)隨訪研究，隨訪截至病人死亡或至2017年10月，隨訪時(shí)間為6～103個(gè)月。病人年齡范圍為27～82歲，年齡(58.45±12.17)歲，其中<55歲78例，≥55歲74例；組織學(xué)分型：漿液性癌107例、黏液性癌24例、宮內(nèi)膜樣癌12例、透明細(xì)胞癌9例；國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics,FIGO)手術(shù)病理分期[9]Ⅰ～Ⅱ期74例、Ⅲ～Ⅳ期78例；腫瘤最長直徑≥5 cm者56例、<5 cm者96例；伴腹部臟器或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者56例；伴腹水者53例。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) 術(shù)后病理確診為上皮性卵巢癌；初治病人，均選擇腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)治療，術(shù)后接受以鉑類為主的聯(lián)合化療；病理、臨床及隨訪資料完整；本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求，病人及近親屬知情同意。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) 既往已接受放療、化療或其他抗腫瘤治療者；隨訪期間失訪者。

1.4 方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)室檢測 試劑：鼠抗人CD133單克隆抗體，兔抗人Snail多克隆抗體，購自美國Abcam；鼠抗人E-cadherin多克隆抗體、DAB顯色試劑盒、ElivisionTMplus試劑盒，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。方法：收集所有對象存檔的手術(shù)標(biāo)本石蠟塊，4 μm連續(xù)切片、烤干，脫蠟至水洗后參考試劑盒說明書進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，選用已知陽性切片為陽性對照，以PBS代替一抗為空白對照。結(jié)果判定：由3名病理醫(yī)師采用多數(shù)法獨(dú)立雙盲閱片判斷免疫組織化學(xué)染色結(jié)果。CD133、E-cadherin蛋白陽性以細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為準(zhǔn)，Snail陽性以細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為準(zhǔn)，表達(dá)結(jié)果從著色強(qiáng)度和范圍兩方面綜合計(jì)分。著色強(qiáng)度：0、1、2、3分分別表示無色、淡黃色、棕黃色、棕褐色；著色范圍：1、2、3、4分分別表示高倍鏡下陽性細(xì)胞占比<10%、11%～50%、51%～75%、>75%，兩者得分乘積為最終得分，積分≤2分為標(biāo)本陰性，>2分為陽性。每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)×400倍視野，取中位值進(jìn)行判定。

1.4.2 觀察指標(biāo) 統(tǒng)計(jì)病人年齡、FIGO 手術(shù)病理分期、組織學(xué)分型、腫瘤直徑、轉(zhuǎn)移及腹水情況。采用電話、門診復(fù)查及上門隨訪等方式對病人進(jìn)行持續(xù)隨訪，觀察病人生存情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0及R語言3.4.2版進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。單因素分析采用χ2檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，采用Log-rankχ2檢驗(yàn)進(jìn)行單因素分析，采用Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型進(jìn)行多因素分析，以明確病人累積生存率的影響因素，自變量篩選方案選擇條件參數(shù)估計(jì)似然比檢驗(yàn)，進(jìn)入標(biāo)準(zhǔn)P<0.05，刪除標(biāo)準(zhǔn)P>0.10。根據(jù)上述影響因素的回歸系數(shù)等信息，利用R語言構(gòu)建累積生存率的列線圖模型和校準(zhǔn)曲線。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD133、E-cadherin、Snail表達(dá)情況 152份病理標(biāo)本中，CD133陽性表達(dá)87例，占57.24%(87/152)，E-cadherin陽性表達(dá)50例，占32.89%(50/152)，Snail陽性表達(dá)89例，占58.55%(89/152)。

2.2 CD133、E-cadherin、Snail表達(dá)與累積生存情況的關(guān)系 病人中位生存時(shí)間51月(95%CI：44.637～57.363月)，1年、3年、5年累積生存率分別為93.4%、63.3%、37.5%。CD133、Snail陽性者，累積生存時(shí)間明顯短于對應(yīng)陰性者(Log-rankχ2=25.762，P<0.001；Log-rankχ2=16.463，P<0.001)，E-cadherin陰性者，累積生存時(shí)間明顯短于陽性者(Log-rankχ2=37.159，P<0.001)，見圖1。

2.3 累積生存率的影響因素分析 經(jīng)Log-rankχ2檢驗(yàn)，除CD133、E-cadherin、Snail表達(dá)情況外，F(xiàn)IGO分型Ⅲ～Ⅳ期、伴腹部臟器或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病人累積生存時(shí)間也分別明顯短于FIGO分型Ⅰ～Ⅱ期、不伴腹部臟器或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病人(Log-rankχ2=7.373，P=0.007；Log-rankχ2=31.023，P<0.001)，而年齡、組織學(xué)分型、腫瘤最長直徑、腹水均與累積生存時(shí)間無明顯關(guān)系(P>0.05)。將CD133、E-cadherin、Snail、FIGO分型、腹部臟器或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移作為自變量，按如下方案賦值：CD133、E-cadherin、Snail陽性為1，陰性為0，F(xiàn)IGO分型Ⅰ～Ⅱ期為1，Ⅲ～Ⅳ期為2，有伴腹部臟器或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為1，無為0，將累積生存情況納為因變量，經(jīng)Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型分析顯示，CD133陽性、伴腹部臟器或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響病人預(yù)后的危險(xiǎn)因素，E-cadherin陽性是影響病人預(yù)后的保護(hù)因素(P<0.05)，見表1。

圖1 CD133、E-cadherin、Snail表達(dá)與上皮性卵巢癌累積生存情況的關(guān)系：A為總體情況；B為CD133與累計(jì)生存情況的關(guān)系；C為E-cadherin與累計(jì)生存情況的關(guān)系；D為Snail與累計(jì)生存情況的關(guān)系

指標(biāo)β值標(biāo)準(zhǔn)誤Waldχ2值P值HR(95%CI)CD133陽性 0.5600.2276.1060.0131.751(1.123～2.730)E-cadherin陽性-0.9050.22216.5780.0000.405(0.262～0.625)伴腹部臟器或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移0.4200.2143.8540.0501.523(1.001～2.317)

2.4 病人預(yù)后的預(yù)測列線圖模型建立 根據(jù)Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型分析結(jié)果，建立基于CD133、E-cadherin是否陽性及有無伴腹部臟器或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的列線圖模型用于預(yù)測病人1年、3年、5年生存率，如圖2。

列線圖預(yù)測值的實(shí)例：某病人CD133、E-cadherin均陽性，伴腹腔臟器轉(zhuǎn)移，則該病人的總評分為：64+0+44=108分，對應(yīng)的術(shù)后1年生存率高于95%，3年生存率約為69%，5年生存率低于50%。

2.5 列線圖模型驗(yàn)證 經(jīng)內(nèi)部驗(yàn)證，該模型一致性參數(shù)C-index=0.699，校準(zhǔn)圖形接近于斜率為1的直線，提示列線圖較準(zhǔn)確地預(yù)測病人術(shù)后死亡風(fēng)險(xiǎn)。見圖3。

3 討論

腫瘤組織中多數(shù)細(xì)胞增殖能力有限，數(shù)次分裂后就會死亡，但小群細(xì)胞具備無限增殖和分化的潛能，這是腫瘤形成、侵襲和轉(zhuǎn)移的重要基礎(chǔ)，此類細(xì)胞即腫瘤干細(xì)胞[10]。CD133可以作為卵巢癌腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物[11]，其高表達(dá)多與FIGO高分期、腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)[12]，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，聯(lián)合CD133檢測對EOC病人的早期診斷、治療及預(yù)后可能有參考價(jià)值[13]。本研究CD133陽性可明顯縮短病人累積生存時(shí)間，提示腫瘤干細(xì)胞水平與病人預(yù)后存在一定的相關(guān)性。EMT具有細(xì)胞極性消失、黏附力下降、細(xì)胞骨架重塑，且獲得間充質(zhì)細(xì)胞遷移、侵襲及抗凋亡的生物學(xué)特性，腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)EMT變化，則能夠獲得干細(xì)胞特性[14]。EMT過程受不同生長因子和信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)信號共同調(diào)節(jié)，相關(guān)研究提示Snail/E-cadherin信號通路與EMT密切相關(guān)[15]：E-cadherin是廣泛存在于上皮組織的鈣依賴性細(xì)胞粘附分子；Snail能夠與其啟動子區(qū)域含有CAGGTG核心堿基序列的E-box元件結(jié)合，從而抑制E-cadherin表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞粘附下降，腫瘤細(xì)胞易脫落并轉(zhuǎn)移。Zhang等[16]發(fā)現(xiàn)高Snail表達(dá)、低E-cadherin表達(dá)多與FIGO高分期、腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)。本研究證實(shí)Snail陽性表達(dá)者及E-cadherin陰性表達(dá)者，其累積生存時(shí)間明顯縮短，提示EMT與病人預(yù)后有一定相關(guān)性。已有研究證實(shí)發(fā)生EMT的細(xì)胞能夠促使腫瘤干細(xì)胞亞群數(shù)量提升，從而使腫瘤細(xì)胞獲得干性，同時(shí)，腫瘤干細(xì)胞又具備間質(zhì)樣細(xì)胞的特點(diǎn)，能夠表達(dá)EMT相關(guān)因子，促進(jìn)EOC腫瘤干細(xì)胞的干性特征產(chǎn)生及CD133表達(dá)，從而導(dǎo)致腫瘤的侵襲性增強(qiáng)，嚴(yán)重影響病人預(yù)后[17]。

圖2 根據(jù)上皮性卵巢癌病人預(yù)后影響因素建立的列線圖模型

圖3 列線圖預(yù)測上皮性卵巢癌病人累積生存率的校準(zhǔn)曲線

Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型指出僅CD133、E-cadherin表達(dá)及是否伴腹部臟器或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與病人預(yù)后相關(guān)，其剔除了Snail表達(dá)情況，可能因后者對病人預(yù)后的影響被其它因素掩蓋所致。目前對EOC病人預(yù)后影響因素的測評，主要基于Cox回歸模型[18-19]，雖有一定指導(dǎo)價(jià)值，但難以為個(gè)體病人提供準(zhǔn)確、具體的生存率信息，仍不能滿足臨床需求。本研究利用Cox回歸分析結(jié)果，結(jié)合R語言，構(gòu)建預(yù)測病人生存率的列線圖模型，結(jié)果顯示其具備良好的內(nèi)部一致性和預(yù)測效能，可能能夠?yàn)槿蘸箝_展同類研究提供參考，即構(gòu)建列線圖模型有助于為病人提供個(gè)體化的生存率預(yù)測信息，這與其他腫瘤報(bào)道[20-21]結(jié)論一致。

綜上，CD133及E-cadherin表達(dá)情況是EOC病人預(yù)后的影響因素，構(gòu)建列線圖能夠有效預(yù)測病人生存率。從發(fā)展前景來看，CD133及E-cadherin聯(lián)合檢測有可能成為評估EOC病人臨床預(yù)后的重要參考指標(biāo)，有必要在嚴(yán)格設(shè)計(jì)的大樣本、多中心研究中進(jìn)一步驗(yàn)證。