程雅婷，王曉云，王艷博，王健，劉凱娜，王學(xué)濤，楊新宇，鄭斕

1.秦皇島市食品藥品檢驗(yàn)中心，河北 秦皇島 066004；2.正大青春寶藥業(yè)有限公司，浙江 杭州 310000

香砂養(yǎng)胃丸為納入我國(guó)基本醫(yī)療保險(xiǎn)目錄的甲類非處方藥，處方由木香、砂仁、白術(shù)、陳皮、茯苓、半夏(制)、醋香附、枳實(shí)(炒)、豆蔻(去殼)、姜厚樸、廣藿香、甘草、生姜、大棗十四味藥組成，具有溫中和胃的功效[1]。方中陳皮、枳實(shí)均源自蕓香科植物，含大量橙皮苷，其中甜橙的橙皮苷含量又遠(yuǎn)高于酸橙[2-10]?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》2015年版一部中對(duì)橙皮苷進(jìn)行了含量測(cè)定并規(guī)定了限度，用以同時(shí)控制陳皮、枳實(shí)的質(zhì)量，方法不僅專屬性差，難以對(duì)二者質(zhì)量進(jìn)行區(qū)別考察，且橙皮苷含量受枳實(shí)品種影響大，難以客觀反應(yīng)陳皮、枳實(shí)的內(nèi)在質(zhì)量。筆者以枳實(shí)的專屬性成分——辛弗林為指標(biāo)，采用HPLC[11-15]測(cè)定香砂養(yǎng)胃丸中辛弗林的含量[16-17]，為控制枳實(shí)的含量提供依據(jù)，對(duì)藥品標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了完善，可用于香砂養(yǎng)胃丸的質(zhì)量控制。

1 抽驗(yàn)情況及發(fā)現(xiàn)問題

2017年河北省評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)中，共抽取香砂養(yǎng)胃丸(水丸)34批次，抽樣單位涉及全省11個(gè)地市，涵蓋全國(guó)5個(gè)省市的13家生產(chǎn)單位。其中經(jīng)營(yíng)單位抽樣27批次，醫(yī)療單位抽樣2批次，生產(chǎn)單位抽樣5批次，分別占抽樣總數(shù)的79.4%、5.9%、14.7%。

按《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版一部檢驗(yàn)橙皮苷的含量，全部符合規(guī)定，但不同批次樣品間結(jié)果差異巨大。橙皮苷為蕓香科柑橘屬植物共有的抗氧化及抗炎活性成分[1-10]，在香砂養(yǎng)胃丸處方中，為陳皮、枳實(shí)共有。陳皮來源單一，原植物為蕓香科植物橘及其栽培變種，枳實(shí)有兩種基原，原植物分別為蕓香科植物酸橙及甜橙。筆者通過比較液相色譜圖并與生產(chǎn)廠家溝通，分別確認(rèn)了每一批樣品中枳實(shí)的基原，并根據(jù)制劑中選用枳實(shí)的不同基原對(duì)橙皮苷含量進(jìn)行箱式圖分析，結(jié)果顯示，以甜橙生產(chǎn)的香砂養(yǎng)胃丸橙皮苷含量高，以酸橙生產(chǎn)的成藥橙皮苷含量低。見圖1。橙皮苷的含量受枳實(shí)基原影響，難以客觀反應(yīng)處方中陳皮、枳實(shí)的含量，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)收載的香砂養(yǎng)胃丸方法中選擇橙皮苷作為指標(biāo)成分同時(shí)控制陳皮、枳實(shí)的質(zhì)量存在不妥。

圖1 不同基原枳實(shí)生產(chǎn)的香砂養(yǎng)胃丸橙皮苷含量對(duì)比箱式圖

2 枳實(shí)指標(biāo)成分的選定

2.1 儀器

島津LC-20AT高效液相色譜儀；METTLER TOLEDO AG-135電子天平。

2.2 試藥

辛弗林對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110727-201608，純度99.9%)；橙皮苷對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110721-201617，純度96.1%)；甲醇、磷酸二氫鉀、十二烷基磺酸鈉(美國(guó)MREDA公司，色譜純)；水為純凈水；冰醋酸為分析純(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)。

枳實(shí)飲片共15批，其中酸橙9批(Y1～Y9)，甜橙6批(Y10～Y15)，分別產(chǎn)自江西(Y1、Y2)、湖南(Y3、Y4、Y12)、浙江(Y5、Y6)、四川(Y10、Y13、Y14)等地，另有部分為安國(guó)藥材市場(chǎng)自購(gòu)(Y7、Y11、Y15)及藥品生產(chǎn)廠家提供(Y8、Y9)。

2.3 方法與結(jié)果

15批枳實(shí)樣品分別按照《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版一部枳實(shí)項(xiàng)下方法測(cè)定辛弗林的含量，又按照香砂養(yǎng)胃丸項(xiàng)下方法測(cè)定橙皮苷的含量，并根據(jù)枳實(shí)的不同基原分別對(duì)辛弗林和橙皮苷的含量進(jìn)行箱式圖分析，結(jié)果顯示，甜橙中橙皮苷含量高，酸橙中橙皮苷含量低。不同基原枳實(shí)中橙皮苷含量差異大，與成藥香砂養(yǎng)胃丸的測(cè)定結(jié)果一致，辛弗林差異較小，更適合作為枳實(shí)質(zhì)量控制的指標(biāo)成分。見圖2～3。

圖2 不同品種枳實(shí)辛弗林含量對(duì)比箱式圖

圖3 不同品種枳實(shí)橙皮苷含量對(duì)比箱式圖

3 含量測(cè)定方法的建立

3.1 儀器

同2.1項(xiàng)下儀器。

3.2 試藥

對(duì)照品及試劑同2.2項(xiàng)下。

香砂養(yǎng)胃丸樣品18批，保定中藥制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)分別為160302(S1)、161005(S2)；北京御生堂集團(tuán)石家莊制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)分別為16034008(S3)、16114008(S4)；河北萬歲藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)為161002(S5)；河南金鴻堂制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)為20160401(S6)；河南明善堂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)為161209(S7)；河南省康華藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)為16101601(S8)、16122901(S9)；江蘇平光信誼(焦作)中藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)為161101(S10)；民生藥業(yè)集團(tuán)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)為161101(S11)；山西旺龍藥業(yè)集團(tuán)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)為20161101(S12)；陜西香菊藥業(yè)集團(tuán)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)為170301(S13)；石藥集團(tuán)河北永豐藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)為10516080514(S14)、10516110114(S15)；藥都制藥集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)為161201(S16)、170401(S17)；湖北瑞華制藥有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號(hào)為170521(S18)。

3.3 色譜條件

島津LC-20AT高效液相色譜儀，色譜柱：WondaSil C18-WR(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-磷酸二氫鉀溶液(取磷酸二氫鉀0.6 g，十二烷基磺酸鈉1.0 g，冰醋酸1 mL，加水溶解并稀釋至1000 mL)(50∶50)；流速為1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量為10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為275 nm；柱溫為30 ℃。理論板數(shù)按辛弗林峰計(jì)算應(yīng)不低于2000。

3.4 對(duì)照品溶液的制備

取辛弗林對(duì)照品適量，精密稱定，加水制成每1 mL含10 μg的溶液，即得。

3.5 供試品溶液的制備

取本品適量，研細(xì)，取約3.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流1.5 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液10 mL，蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，通過聚酰胺柱(60～90目，2.5 g，內(nèi)徑1.5 cm，干法裝柱)，用水25 mL洗脫，收集洗脫液，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得。

3.6 專屬性考察

按處方及工藝要求制備枳實(shí)、陳皮的陰性樣品并按3.5項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液，依次精密吸取對(duì)照品溶液、樣品溶液及陰性樣品溶液各10 μL，按3.3項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果表明香砂養(yǎng)胃丸中其他成分不影響辛弗林的檢出，本方法專屬性強(qiáng)，見圖4。

注：A.對(duì)照品；B.樣品；C.陰性對(duì)照品；1.辛弗林。圖4 香砂養(yǎng)胃丸及其對(duì)照品、樣品、陰性HPLC圖

3.7 精密度考察

取同一對(duì)照品溶液，按3.3項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄辛弗林色譜峰的峰面積，結(jié)果RSD為0.35%。儀器精密度良好。

3.8 線性關(guān)系考察

配制系列濃度對(duì)照品溶液，使每1 mL分別含辛弗林0.732 5、3.662、7.325、14.65、29.30、58.60、117.2 μg，按3.3項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)，濃度(X，μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得回歸方程Y=10 308.20X+128.66，r=0.999 9；進(jìn)樣量在14.65～2344 ng與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

3.9 穩(wěn)定性考察

取同一樣品(S1)，按3.5項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h按3.3項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，峰面積RSD為0.42%。供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.10 重復(fù)性考察

取同一樣品(S1)，按3.5項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6份，按3.3項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算含量，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.304 0 mg·g-1，RSD為1.75%。該方法重復(fù)性好。

3.11 加樣回收率考察

精密稱取已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)(S1，0.304 0 mg·g-1)的樣品9份，每份約1.8 g，平行分為3組，每組分別加入低、中、高3個(gè)濃度的對(duì)照品，按3.5項(xiàng)下方法制備供試品溶液并按3.3項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算平均回收率為94.8%，RSD值為2.72%。結(jié)果表明，本方法加樣回收較好，見表1。

表1 香砂養(yǎng)胃丸中辛弗林加樣回收率結(jié)果(n=9)

3.12 耐用性考察

3.12.1 色譜柱的考察 考察了日本Inertsustain C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm)色譜柱及Wondasil C18-WR(250 mm × 4.6 mm，5 μm)色譜柱，均能達(dá)到較好的分離效果，樣品測(cè)定結(jié)果RSD為0.53%，測(cè)定結(jié)果一致。

3.12.2 高效液相色譜儀的考察 分別考察了島津LC-20AT、Waters 2695、Agilent 1260 3種品牌的高效液相色譜儀，結(jié)果相同樣品的測(cè)定結(jié)果RSD為0.95%，測(cè)定結(jié)果一致。

3.13 樣品測(cè)定

取全部18批樣品，按3.5項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按3.3項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果見表2。

表2 香砂養(yǎng)胃丸中辛弗林含量測(cè)定結(jié)果 mg·g-1

4 討論

4.1 提取方法的考察

本實(shí)驗(yàn)參考《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版一部枳實(shí)【含量測(cè)定】項(xiàng)下的提取方法，分別以甲醇、流動(dòng)相為提取溶劑對(duì)樣品前處理后進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果以流動(dòng)相為提取溶劑的樣品色譜圖干擾峰多，影響主成分峰分離度，而以甲醇為提取溶劑的分離效果好。實(shí)驗(yàn)繼續(xù)考察了溶劑加入量、上柱洗脫用水量對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，最終確定3.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液。

4.2 現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)薄層鑒別的改進(jìn)

本實(shí)驗(yàn)對(duì)收集的全部香砂養(yǎng)胃丸樣品(S1～S18)按照《中華人民共和國(guó)藥典》一部規(guī)定方法——以枳實(shí)(酸橙)為對(duì)照藥材進(jìn)行枳實(shí)薄層色譜鑒別，結(jié)果薄層鑒別圖譜差異大，部分出現(xiàn)假陰性結(jié)果。為探究原因，筆者分別用不同基原枳實(shí)飲片(Y1～Y15)分別按照香砂養(yǎng)胃丸中枳實(shí)的薄層色譜鑒別方法進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果酸橙為陽(yáng)性，甜橙薄層色譜斑點(diǎn)不易見，為假陰性，證明香砂養(yǎng)胃丸中枳實(shí)薄層色譜的差異是由枳實(shí)來源不同引起的。建議中國(guó)食品藥品檢定研究院調(diào)整枳實(shí)對(duì)照藥材的品種，增加或更換甜橙作為枳實(shí)對(duì)照藥材。

4.3 制訂枳實(shí)炮制工藝的建議

香砂養(yǎng)胃丸處方中為炒枳實(shí)，《中華人民共和國(guó)藥典》一部枳實(shí)項(xiàng)下記載麩炒枳實(shí)的含量測(cè)定方法及限度均與藥材相同[1]。有文獻(xiàn)報(bào)道，根據(jù)炮制時(shí)間、炮制溫度、麩用量的不同，辛弗林、橙皮苷等有效成分亦隨之增減[18-20]。經(jīng)市場(chǎng)調(diào)查，炒枳實(shí)為各生產(chǎn)企業(yè)自行炒制，因《中華人民共和國(guó)藥典》中未明確規(guī)定炮制的工藝，各廠家在炒制時(shí)間、溫度等方面掌控不同。為從源頭穩(wěn)定麩炒枳實(shí)的質(zhì)量，建議國(guó)家藥典委員會(huì)制訂科學(xué)的麩炒枳實(shí)的炮制工藝。