汪祺，王亞丹，楊建波，劉越，文海若，馬雙成

中國食品藥品檢定研究院，北京 100050

芫花Genkwa Flos為瑞香科植物芫花DaphnegenkwaSieb.et Zucc.的干燥花蕾。其性溫，味苦、辛，有毒[1]。在中國應用較為廣泛，為傳統(tǒng)峻下逐水藥。藥理研究表明，芫花具有利尿、鎮(zhèn)咳、祛痰、抗腫瘤及免疫調節(jié)等作用[2-3]。由于其明確的抗腫瘤活性，臨床長期應用所導致的不良反應屢次出現(xiàn)，其中，肝損傷所占比例最為嚴重[4-7]。

有學者通過血清生化指標和組織病理學篩選相結合的方法，初步證明芫花所致肝毒性部位集中在乙醇提取物的三氯甲烷萃取部分，其中芫花素含量較高。另有文獻報道，芫花乙醇提取物中芫花素質量分數(shù)可高達6.06%。該實驗同時采用體外方法證明，芫花醇提物可顯著抑制大鼠肝微粒體(RLM)和人肝微粒體(HLM)中尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶(UDP-glucuronosyltransferases，UGTs)活性[8]，但醇提物中何種成分產生的抑制作用并未闡明，因此有待進一步考察研究。

UGTs酶是人體內重要的Ⅱ相代謝酶系，具有可催化脂溶性化合物及內源性物質的作用。被催化化合物多具有羥基、巰基、胺基、羧基和烯醇基團，經過UGTs酶系代謝后，這類物質水溶性增加，可隨尿及膽汁外排出體外，從而防止其在體內蓄積產生毒性[9-10]。UGTs家族中非常重要的一員為UDP-葡萄糖醛酸轉移酶1A1(UGT1A1酶)，該酶是內源性物質膽紅素的唯一代謝酶。膽紅素是人體內一種非常重要的內源性物質，是血紅細胞的代謝產物，在臨床上是判定黃疸的重要依據，同時也是肝功能和肝損害的重要生物標志物。因此通過考察藥物對UGT1A1介導的膽紅素葡萄糖醛酸結合的影響可用于預測該藥物對肝臟是否具有潛在毒性作用。本實驗擬在前期實驗基礎上，首先采用計算機分子對接手段初步預測芫花中主要單體成分芫花素對UGT1A1酶的活性影響，此外同時采用體外人肝微粒體溫孵體系，評價其對UGT1A1酶的抑制作用，綜合兩部分實驗結果對其潛在毒性進行初步評價。由于前期實驗已經考察了芫花醇提物對不同種屬中UGT1A1酶的抑制作用，并未見明顯差異，因此本研究僅采用HLM進行實驗研究[8]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters AcquityTMUltra Performance LC超高效液相色譜儀(Waters公司，美國)，節(jié)能型職能恒溫槽SDC-6(寧波新芝生物科技股份有限公司)，METTLER TOLEDO AE240型電子天平(梅特勒-托利多公司，瑞士)，Thermo 17R型高速低溫離心機(Thermo公司，日本)。

1.2 材料與試劑

人肝微粒體(human liver microsome，HLM，50 donors)購自美國BD Gentest公司；磷酸鉀(純度≥98%)、抗壞血酸(純度≥98%)、氯化鎂(純度≥98%)、三羥甲基氨基甲烷(Tris，純度≥98%)、膽紅素(純度≥98%)均購自百靈威科技有限公司，丙甲菌素(純度≥98%)、葡萄糖二酸單內酯(純度≥98%)、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(UDPGA，純度≥98%)、二甲基亞砜(DMSO，純度≥98%)均購自Sigma Aldrich公司，芫花素(批號：111899-201202，純度：94.9%)購自中國食品藥品檢定研究院。甲酸、鹽酸均為分析純(北京化學試劑廠)，乙腈、甲醇均為色譜純(Fisher公司)。

2 方法

2.1 同源模建

UGT1A1(Uniprot/P25101)是由534個氨基酸殘基組成的Ⅱ相代謝酶，由于目前尚未確定UGT1A1的N-末端結構域，前期實驗采用Discovery Studio 2.5 BLAST Search模塊進行序列比對，分析其同源性、相似性高低，選擇相似性最高的4種蛋白作為模板進行同源模建。實驗應用Modeller 9.13程序，首先基于逐級能量最小化方法采用最陡下降法和共軛梯度法進行優(yōu)化，約束所有重原子，優(yōu)化氫原子、側鏈及Loop區(qū)。其次基于拉氏圖和Profile-3D分析對同源模建蛋白進行評價，最終構建出UGT1A1酶蛋白結構[11]。

2.2 分子對接實驗

利用Discovery Studio 2.5的From Receptor Cavities模塊對蛋白空腔進行自動識別，并利用活性值與打分值的相關性系數(shù)對活性口袋進行評價，分析待測單體芫花素與UGT1A1酶蛋白的作用方式，同時計算二者復合物結合自由能，用以判斷親和作用強弱。

2.3 人肝微粒體體外抑制實驗

2.3.1 色譜條件 Acquity UPLC HSS C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；預柱：Acquity UPLC HSS C18VanGuard Pre-column(2.1 mm×5 mm，1.8 μm)；流動相：乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～2.1 min，40%A→75%A；2.1～4.2 min，75%A→95%A；4.2～8.0 min，95%A；8.0～8.5 min，95%A→40%A；8.5～12.5 min，40%A)；流速：0.4 mL·min-1；柱溫：35 ℃；檢測波長：450 nm；進樣量：10 μL[12]。

2.3.2 UDPGA-發(fā)生系統(tǒng)的制備 精密稱取丙甲菌素、氯化鎂、葡糖二酸單內酯、UDPGA適量，加Tris-HCl緩沖液使溶解(Tris-HCl緩沖液：取Tris 121.1 g，加入去離子水800 mL，加濃鹽酸調pH至7.4，去離子水定容至1000 mL)，其中含氯化鎂5 mmol·L-1，丙甲菌素25 μg·mL-1，葡糖二酸單內酯5 mmol·L-1，UDPGA 5mmol·L-1，即得[12]。

2.3.3 孵育體系溶液的制備 采用人肝微粒體孵育體系(HLM)，以表觀抑制常數(shù)Ki為評價指標，測定芫花素對UGT1A1酶的抑制作用。取蛋白質量濃度為0.5 mg·L-1的HLM 30 μL放至室溫復融，分別加入系列濃度的膽紅素(UGT1A1酶底物)對照品溶液(0.52～2.37 μmol·L-1)及待測單體芫花素對照品溶液(0.16～12 μmol·L-1)，置37 ℃ 恒溫水浴預孵育3 min，加入新鮮配制的UDPGA-發(fā)生系統(tǒng)溶液68 μL啟動反應。反應10 min后立即加入600 μL冰乙腈-甲醇(2∶1，含抗壞血酸濃度為200 μmol·L-1)沉淀蛋白終止反應，渦旋1 min后于13 000 r·min-1離心25 min，取上清液進行測定[DMSO總用量不超過1%(V/V)][13-14]。

3 結果

3.1 UGT1A1酶蛋白活性區(qū)確定

利用Discovery Studio 2.5的From Receptor Cavities模塊對UGT1A1蛋白空腔進行自動識別，共獲得9個口袋(A-I活性口袋)，坐標及半徑如表1所示。

表1 結合位點信息表

3.2 分子對接實驗結果

將單體芫花素(結構見圖1)與UGT1A1酶蛋白進行對接，選擇能夠接納化合物且相關系數(shù)相反數(shù)最大的口袋作為活性口袋。對接結果顯示，芫花素在site F的打分值為81.643 7，高于其他活性位點的打分值，因此芫花素的結合口袋確定為site F(對接模式見圖2)。

圖1 芫花素結構圖

圖2 芫花素與UGT1A1酶對接模式圖

在確定芫花素對接區(qū)域后，采用Discovery Studio 2.5中CDOCKER打分功能，對其與靶標蛋白UGT1A1的結合位點進行結合自由能(IE，kcal·mol-1)分析，IE值絕對值越大，代表體系能量越穩(wěn)定，結合能力更強。由實驗結果可知，芫花素與UGT1A1的 IE 值為31.303 4 kcal·mol-1，證明其與酶的結合能力較強；同時，前期實驗[11]表明膽紅素結合活性區(qū)為F區(qū)，與芫花素存在競爭結合的可能，因此進一步提示芫花素對于UGT1A1酶結合底物膽紅素存在較大影響，具有一定的安全性風險。

3.3 人肝微粒體體外抑制實驗結果

分別以膽紅素總代謝產物(單葡萄糖醛酸膽紅素及雙葡萄糖醛酸膽紅素)生成量對底物膽紅素濃度做圖，以米氏方程雙倒數(shù)做圖法進行計算測定，橫坐標為膽紅素濃度的倒數(shù)(1/S)，縱坐標為加入芫花素后膽紅素代謝反應速率的倒數(shù)(1/V)；加入不同濃度芫花素對應不同曲線，將不同曲線的斜率對應相應底物膽紅素濃度繪制slop圖(圖3)，求得抑制常數(shù)Ki[12，15]。由實驗結果可知，芫花素的Ki值為27.0 μmol·L-1，對UGT1A1酶表現(xiàn)為中強抑制作用，由圖3可知抑制類型為競爭型抑制，證明芫花素可與底物膽紅素競爭性結合UGT1A1酶，繼而抑制其酶活性，體外實驗結果與計算機對接結果相一致。

注：A.米氏方程雙倒數(shù)圖；B.slop斜率圖。圖3 芫花素對UGT1A1酶動力學參數(shù)的影響

4 討論

內源性物質膽紅素在人體內的代謝及調節(jié)為一復雜生理過程[16]，任何環(huán)節(jié)發(fā)生病理改變均可導致膽紅素代謝受阻、蓄積，繼而引發(fā)肝毒性反應。目前已知UGT1A1酶為膽紅素在體內的唯一代謝酶，因此本實驗以此為切入點，從UGT1A1代謝酶抑制可引發(fā)潛在肝毒性反應為出發(fā)點，考察芫花中主要單體成分芫花素致肝毒性風險。

實驗首先通過分子對接技術構建UGT1A1酶蛋白結構，將待測單體芫花素與UGT1A1酶蛋白對接，明確二者結合靶點以及結合強弱，初步推測芫花素與UGT1A1酶的結合位點為活性區(qū)F，與其底物膽紅素活性位點重合，且芫花素與UGT1A1酶親和性較強，因此提示芫花素可競爭型抑制UGT1A1酶代謝底物膽紅素的酶活性，具有潛在肝毒性風險。另一方面，體外人肝微粒體實驗結果顯示，芫花素對人源UGT1A1酶具有中強抑制作用，抑制類型為競爭型抑制，與計算機分子對接結果相一致。

綜上所述，本實驗所構建的UGT1A1酶蛋白模型可用于藥物的初期安全性評價篩選，可有效預測藥物的潛在用藥風險。計算機分子對接實驗及體外人肝微粒體抑制實驗均提示芫花素對UGT1A1酶存在抑制作用，可與其底物膽紅素產生競爭型抑制，繼而引發(fā)肝毒性。本研究將計算機模擬技術應用于預測藥物潛在肝毒性風險的嘗試，為中藥安全性評價提供了新的思路。