陳靖昀,于書(shū)劍,肖 冬*

(1.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院，吉林 延邊133002；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科,吉林 長(zhǎng)春130021)

喉癌(laryngeal cancer，LC)是頭頸部常見(jiàn)的惡性腫瘤，中國(guó)東北地區(qū)為喉癌高發(fā)區(qū),喉癌治療主要以手術(shù)和放療為主，化療為輔。近年來(lái)隨著對(duì)腫瘤研究的不斷深入發(fā)現(xiàn)，具有有強(qiáng)的遷徙、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移能力和分化潛能腫瘤干細(xì)胞,是腫瘤發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要因素[1]。國(guó)內(nèi)外研究者通過(guò)比較干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞發(fā)現(xiàn)兩者有驚人的相似之處：譬如同樣具有自我更新和分裂增殖能力，同樣有Notch、Wnt、Sonichedgehog(Shh)、PI3K/PTEN/AKT和Bm-i1等信號(hào)通路參與細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育；具有遷移或轉(zhuǎn)移能力[2]。這些相似點(diǎn)暗示在腫瘤組織中可能存在一小部分非腫瘤細(xì)胞,與其它機(jī)體干細(xì)胞一樣具有自我更新和無(wú)限增殖的能力，而這一小部分細(xì)胞便是腫瘤干細(xì)胞。CD133是具有5個(gè)跨膜區(qū)的糖蛋白，有研究發(fā)現(xiàn)，在人喉癌細(xì)胞系Hep-2中有3.22%的微量細(xì)胞呈陽(yáng)性表達(dá)[3]，Hep-2 CD133+陽(yáng)性細(xì)胞在體外分化、增值能力及體外成瘤能力方面強(qiáng)于CD133-陰性細(xì)胞[4,5]，CD133可能是喉癌干細(xì)胞的標(biāo)志之一。同時(shí)，在腦腫瘤[6]、非小細(xì)胞肺癌[7]、前列腺癌[8]及肝癌干細(xì)胞中都有CD133表達(dá)的報(bào)道[9]，目前越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)證實(shí)CD133+細(xì)胞與腫瘤信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、腫瘤的免疫逃逸、多藥耐藥現(xiàn)象和放療抵抗均有相關(guān)性，CD133+細(xì)胞可望成為喉癌干細(xì)胞治療的靶點(diǎn)[10]。

國(guó)內(nèi)外對(duì)刺五加(Acanthopanax senticosus Harms)的藥理作用研究表明：刺五加中，其中提取的苷類、黃酮、多糖、和礦物質(zhì)等活性成分具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗衰老、抗輻射損傷及抗疲勞等[11-14]生物活性作用。而刺五加多糖(ASPS)已被證實(shí)具有抗衰老、降血脂、抗病毒、抗腫瘤、提高免疫力等功效，國(guó)內(nèi)外研究顯示，其具體機(jī)制可能于調(diào)節(jié)免疫相關(guān)功能相關(guān)，通過(guò)提高淋巴細(xì)胞增殖活性，并增加血液中T淋巴細(xì)胞的的亞群含量，增強(qiáng)細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞的殺傷活性，促進(jìn)多種細(xì)胞因子及干擾素的合成，來(lái)抑制腫瘤生長(zhǎng)[15,16]，但是在抑制腫瘤生長(zhǎng)的過(guò)程中發(fā)揮怎樣的免疫調(diào)節(jié)作用，具體機(jī)制尚不明確。

本實(shí)驗(yàn)以體外研究喉癌干細(xì)胞作為對(duì)象，采用CCK-8法、基因測(cè)序分析法、Western blot 通過(guò)檢測(cè)刺五加多糖ASPS 對(duì)Bcl-2和PD-L1蛋白表達(dá)的影響，初步探討ASPS抑制喉癌干細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

免疫磁珠法對(duì)喉癌Hep-2細(xì)胞分選，優(yōu)化Hep-2中含有CD133陽(yáng)性標(biāo)志的干細(xì)胞比例，給予不同濃度的刺五加多糖ASPS，比較其細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)，通過(guò)Western Blot方法分析刺五加多糖ASPS作用喉癌干細(xì)胞作用的機(jī)制。

Hep-2細(xì)胞系由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供。Hep-2 細(xì)胞加入培養(yǎng)液 為含 10 %小牛血清、青霉素和鏈霉素各 100 U/ml 的RPMI1640 培養(yǎng)液中,置37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。0.25%的胰蛋白酶消化傳代。

刺五加多糖ASPS購(gòu)于陜西慈緣生物幾首有限公司(NO.CY180310)，細(xì)胞培養(yǎng)基1640購(gòu)自美國(guó)Gibico公司， 胎牛血清購(gòu)自 Hyclone 公司，免疫磁珠干細(xì)胞提取試劑盒購(gòu)于stemcell公司，CCK-8購(gòu)自東仁化學(xué)科技有限公司，凋亡流式檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司。兔抗人Bcl-2、Bax、Caspase-3、抗體購(gòu)自abcam公司。

1.1 Hep-2 CD133陽(yáng)性細(xì)胞分選

取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)細(xì)胞，制成1 mL 108單細(xì)胞懸液，細(xì)胞懸液中添加100 μl FcR blocking和5 μl PE-conjugated CD133 antibody 靜置15 min，加入100 μl PE selection cocktail 混勻靜置 15 min，向懸液中加入50 μl 磁珠懸液Magnetic Nanopatricles 10min，將混勻后的細(xì)胞懸液置入磁極5 min，拿起磁極倒出懸液，加入PBS重新混勻細(xì)胞，重復(fù)放入磁極和倒出的步驟3次，收集CD133陽(yáng)性細(xì)胞，并利用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分選純度驗(yàn)證。

1.2 干細(xì)胞腫瘤成球?qū)嶒?yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hep-2 CD133陽(yáng)性細(xì)胞，分為對(duì)照及刺五加多糖ASPS5 μg/mL給藥組，以每孔1000個(gè)接種于超低吸附培養(yǎng)六孔板中，每2天更換成球?qū)嶒?yàn)培養(yǎng)基(EGF 20 ng/mL， bFGF 10 ng/mL， B27 1%)，并觀察計(jì)數(shù)Hep-2 CD133的成球情況，培養(yǎng)14天，拍照，計(jì)算成球率，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)對(duì)照，每孔計(jì)數(shù)3次，取平均值。

1.3 CCK-8法測(cè)定細(xì)胞對(duì)刺五加ASPS的敏感性

選取對(duì)數(shù)期Hep-2 CD133細(xì)胞，調(diào)整密度為5×104 ml-1，接種于96孔細(xì)胞，每孔接種于96孔板，每孔100 μl，再分別加入不同濃度的刺五加多糖ASPS培養(yǎng)72 h候，每孔加入10 μl CCK-8，孵育30 min后，測(cè)定OD值，并計(jì)算細(xì)胞抑制率。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡的變化

分別收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 Hep-2 和Hep-2 CD133陽(yáng)性的細(xì)胞，胰酶消化，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度。置于恒溫 37℃，5%CO2，95%相對(duì)濕度的孵箱中培養(yǎng) 24 h 至細(xì)胞密度為80%。進(jìn)行Annexin-V/PI 凋亡標(biāo)記及檢測(cè)。

按 Annexin V-FITC Kit 試劑說(shuō)明書(shū)試劑(細(xì)胞數(shù)≤106個(gè)為例，如果細(xì)胞數(shù)>106 試劑相應(yīng)加倍)：加 1 ml 1×binding Buffer，300× g 離心 10 min，移去上清(此步驟可重復(fù) 1 次)；加入 100 μl 1×binding Buffer 重懸細(xì)胞；加 10 μl Annextin V-FITC，混勻后室溫下孵育 15 min；加 1 ml 1×binding Buffer，300× g離心 10 min，移去上清；加入 500 μl 1×binding Buffer重懸細(xì)胞.流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞率。

1.5 Western Blot

Wetserblot Blot 方法檢測(cè)給予刺五加多糖ASPS前后相關(guān)蛋白變化情況，用蛋白裂解液于冰上裂解 給予刺五加多糖ASPS前后的Hep-2 CD133 30 min，4℃ 12 000×g離心40 分鐘,取上清-80℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?上清用 Bradford 法測(cè)定蛋白濃度,樣品 95℃變性5 min后,每孔上樣60 μg,SDS-PAGE(5%stacking gel,8% separating gel)電泳 80 伏2 小時(shí)轉(zhuǎn)膜于 PVDF 膜上,用 4%脫脂奶粉/TBST 室溫下封閉抗原 1.5 小時(shí) 。一抗用 4%脫脂奶粉/TBST 稀釋后 4℃孵育 PVDF 膜過(guò)夜。TBST 洗膜三次,每次10 min 然后加入二抗,室溫下?lián)u床孵育 1小時(shí),再次 TBST 洗膜三次,每次10 min。ECL 曝光顯影。圖像分析儀定量分析表達(dá)蛋白的光密度。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用Spss17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)提供形式為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，P<0.05 位有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 喉癌Hep-2 干細(xì)胞分離

Hep-2細(xì)胞CD133的表達(dá)率如圖， 可以看出分選前CD133 在hep-2細(xì)胞的含量為3.8%，免疫磁珠法兩次分選后，CD133 陽(yáng)性表達(dá)率最終為84.5%，免疫磁珠法分選效率較高。

圖1 喉癌Hep-2細(xì)胞中CD133細(xì)胞的分離

2.2 腫瘤成球?qū)嶒?yàn)

EGF 20 ng/mL， bFGF 10 ng/mL，B27 1%培養(yǎng)14天后，分別觀察并計(jì)數(shù)兩組細(xì)胞的成球率，Hep-2 CD133組的成球率為69.33%±2.96%，刺五加100 μmol/L ASPS給藥組的成球率為 49.67%±4.18%，兩組統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P<0.05，說(shuō)明刺五加ASPS可以明顯抑制腫瘤干細(xì)胞的成球率。

圖2 干細(xì)胞成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在超凈臺(tái)中將 96 孔板中培養(yǎng)基換為不含血清及抗生素的 1640 培養(yǎng)基100 μl，然后加入 CCK-8 試劑 10 μl；在 96 孔板中選擇未使用的空加不含血清及抗生素的 1640 培養(yǎng)基 100 μl及 CCK-8 試劑 10 μl作為空白組，37℃度孵育2 h；測(cè)值：在酶標(biāo)儀 450 nm 處檢測(cè)吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞生存率。細(xì)胞生存率=(實(shí)驗(yàn)組 A 值-空白組 A 值)/(空白對(duì)照組 A 值-空白組 A 值)×100%。

結(jié)果可以看出隨著時(shí)間及刺五加多糖劑量的不斷增加，刺五加多糖ASPS對(duì)Hep-2及Hep-2 CD133陽(yáng)性細(xì)胞有明顯抑制作用，其中100 mg/L劑量的ASPS對(duì)兩種細(xì)胞抑制作用最明顯。

圖3 CCK8 檢測(cè)刺五加作用喉癌CD133干細(xì)胞細(xì)胞的活性變化

2.4 刺五加對(duì)Hep-2細(xì)胞和Hep-2 CD133細(xì)胞凋亡

不同濃度刺五加多糖作用Hep-2 和Hep-2 CD133凋亡流式結(jié)果如圖5所示，可以看出隨著刺五加多糖濃度的增加，Hep-2及Hep-2 CD133細(xì)胞凋亡率不斷增加，并且Hep-2 CD133細(xì)胞對(duì)100 mg /L的刺五加多糖敏感性更高，凋亡細(xì)胞數(shù)明顯高于Hep-2，說(shuō)明Hep-2 CD133細(xì)胞對(duì)刺五加多糖更敏感。

圖4 CCK 8 檢測(cè)刺五加作用喉癌Hep-2細(xì)胞的活性變化

2.5 Western Blot

Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，給予100 mg/L的刺五加多糖后Hep-2 CD133中的PD-L1和Bcl2表達(dá)程度較之前有明顯降低的趨勢(shì)(P<0.05)，說(shuō)明刺五加多糖有抑制促癌基因Bcl2和細(xì)胞程式死亡配體PD-L1表達(dá)的作用，其發(fā)揮抑制Hep-2 CD133細(xì)胞的作用可能與抑制Bcl2和PD-L1相關(guān)。

3 討論

喉癌是頭頸部腫瘤中的惡性腫瘤之一，目前對(duì)喉癌主要采用手術(shù)結(jié)合放化療的綜合治療方法，其中，目前許多個(gè)觀點(diǎn)認(rèn)為，頭頸腫瘤的惡性病變與腫瘤干細(xì)胞密切相關(guān)。

腫瘤干細(xì)胞(CSCs)是一類具有自我更新、分化和致瘤能力的癌細(xì)胞亞群[17]，在維持腫瘤惡性增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)等方面起著決定性作用[18,19]。目前，喉癌干細(xì)胞標(biāo)記物的研究仍處于起步階段，CD133 是一種跨膜糖蛋白，在造血干細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞及一些正常組織的干細(xì)胞中普遍表達(dá)，是多種腫瘤的干細(xì)胞標(biāo)記物[20]，有研究表明，CD133 存在于頭頸腫瘤中，并且與頭頸腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移、放化療耐受密切相關(guān)[3,21,22]。MACS(免疫磁珠分選技術(shù))是一種高度特異性的細(xì)胞分離技術(shù)，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于癌癥研究、免疫學(xué)及干細(xì)胞研究中，與流式等其他分選細(xì)胞技術(shù)相比，MACS 是一個(gè)相對(duì)簡(jiǎn)單、效果好并且節(jié)約成本的方法，同時(shí)，MACS 對(duì)細(xì)胞損傷小，可以很好的保持細(xì)胞活力，本實(shí)驗(yàn)中，我們通過(guò)免疫磁珠分選技術(shù)分選出CD133陽(yáng)性干細(xì)胞，并利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分選后 CD133的表達(dá)，提示MACS能有效富集干細(xì)胞。

圖5 流式細(xì)胞方法檢測(cè)刺五加ASPS對(duì)兩種細(xì)胞的促進(jìn)凋亡作用

圖6 刺五加多糖對(duì)Hep-2 CD133中 Bcl2和PD-L1的表達(dá)作用影響

PD-1/PD-L1免疫信號(hào)通路發(fā)揮多種生理功能，在T細(xì)胞參與的免疫應(yīng)答中，向T細(xì)胞傳遞抑制性信號(hào)，同時(shí)PD-1偶聯(lián)受體可以抑制PI3K/AKT和Ras/MEK/Erk通路，與腫瘤細(xì)胞上的PD-L1共同作用從而抑制B細(xì)胞活化誘導(dǎo)T細(xì)胞耗竭，減弱機(jī)體的免疫功能，阻斷腫瘤負(fù)調(diào)控PD-1/PD-L1結(jié)合可增強(qiáng)抗腫瘤免疫能力，從而控制腫瘤的發(fā)展，重塑集體對(duì)腫瘤的免疫應(yīng)答功能[23,24]。因此，作用于抗PD-1和抗PD-L1抗體靶點(diǎn)，從而阻斷PD-1/PD-L1信號(hào)通路的免疫治療的藥物在腫瘤治療中已取得廣泛認(rèn)可。同時(shí)，Bcl-2蛋白家族在細(xì)胞凋亡過(guò)程中有著重要的調(diào)控作用。

本實(shí)驗(yàn)采用免疫磁珠分選技術(shù)，以喉癌干細(xì)胞標(biāo)記物 CD133為標(biāo)記篩選 Hep-2中的干細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)及相關(guān)蛋白表達(dá)分析，刺五加多糖ASPS具有抑制喉癌干細(xì)胞增殖的作用，其作用機(jī)制可能與刺五加多糖ASPS通過(guò)影響PD-L1和Bcl-2表達(dá)水平 促進(jìn)干細(xì)胞細(xì)胞凋亡，從而抑制CD133干細(xì)胞的增殖，但具體機(jī)制需要進(jìn)一步驗(yàn)證。