王 紅，蔣 莉，王 巖，許振凱，王威平，方 航， 孫 鵬,白曉春1，2，3，*

(1.南方醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院，廣東 廣州510630；2.廣東省骨科研究院，廣東 廣州510630；3.廣東省骨科醫(yī)院，廣東 廣州510630；4.吉林大學第一醫(yī)院 急診科，吉林 長春130021；5.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院科學研究中心，吉林 長春130033；6.南方醫(yī)科大學，廣東 廣州510515；7.中山大學腫瘤防治中心麻醉科，廣東 廣州510060；8.華南腫瘤學國家重點實驗室廣東 廣州510060；9.腫瘤醫(yī)學省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，廣東 廣州510060)

結(jié)節(jié)性硬化復合物1(Tuberous sclerosis complex1,TSC1)，是人類的一種抑癌基因，與哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(The mammalian target of rapamycin，mTOR)有著密切的聯(lián)系。目前研究發(fā)現(xiàn)，mTOR能整合細胞內(nèi)外各種信號，是機體與細胞感受營養(yǎng)的信號通路[1]。TSC1位于mTOR信號通路的上游，對mTOR有一定抑制作用。既往研究主要集中mTOR信號通路對心腦疾病及腫瘤發(fā)病機制的探討，而近期實驗發(fā)現(xiàn)mTOR信號通路在骨骼發(fā)育過程中發(fā)生變化[2,3]，但機制仍未闡明。骨骼發(fā)育過程中，肢芽干細胞、軟骨細胞及成骨細胞是其主要構(gòu)成部分，闡明3者與mTOR信號通路的關(guān)系，將為骨骼發(fā)育提供新視野。

本研究擬構(gòu)建肢芽干細胞特異性TSC1敲除小鼠(Prx-1-Cre；TSC1flox/flox)、軟骨細胞特異性TSC1敲除小鼠(Col2a1-Cre；TSC1flox/flox)、成骨細胞特異性TSC1敲除小鼠(Osx-Cre；TSC1flox/flox)，為進一步研究mTOR信號通路調(diào)控骨骼發(fā)育的機制提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗動物：TSC1-loxP小鼠(品系號：005680)、Prx-1-Cre小鼠(品系號：006361)和Osx-Cre小鼠(品系號：006361)均購自美國的The Jackson Laboratory。不可誘導Col2a1-Cre小鼠(品系號：003554)為軍事醫(yī)學科學院贈與。用于保種繁殖和階段性年齡相關(guān)的野生型黑背景C57BL/6小鼠，均購自南方醫(yī)科大學實驗動物中心。主要材料：瓊脂果糖、GelRed等。

1.2 方法

1.2.1小鼠繁殖與分組 在SPF級動物飼養(yǎng)室繁殖小鼠，溫度控制在25°左右，濕度保持70%左右。首先利用不可誘導Col2a1-Cre小鼠和TSC1-loxP小鼠交配，繁殖出攜帶有雜合Col2a1-Cre和雜合TSC1-loxP位點的小鼠，基因型為TSC1flox/-Col2a1-Cre的F1代小鼠。待小鼠成年后，繼續(xù)與TSC1-loxP小鼠交配，繁殖出雜合Col2a1-Cre和純合TSC1-loxP位點的小鼠，基因型為帶Col2a1-Cre的TSC1flox/flox的F2代純合子小鼠，此為軟骨細胞特異性敲除TSC1轉(zhuǎn)基因小鼠(Col2a1-Cre；TSC1flox/flox)。 同窩帶Col2a1-Cre的TSC1flox/flox小鼠分組為Col2a1-TSC1 CKO組，正常的小鼠(如Col2a1-Cre；TSC1flox/-，TSC1flox/flox)分組為正常組(Con組)。

用以上的繁殖方法可獲得帶Prx-1-Cre的TSC1flox/flox純合子小鼠、帶Osx-Cre的TSC1flox/flox純合子小鼠，并分組為Prx-1-TSC1 CKO組、Osx-TSC1 CKO組。

小鼠基因型鑒定引物序列：

Prx-1-Cre primer forward:5′-TCCAATTTACTGACCGTACACCAA-3′

Prx-1-Cre primer forward:5′-CCTGATCCTGGCAATTCGGCTA-3′

Col2a1-Cre primer forward:5′-GCATCGACCGGTAATGCAGGC-3′

Col2a1-Cre primer reverse:5′-GAGGGTCCAGCCCGAGCTACTT-3′

Osx-Cre primer forward:5′-CTCTTCATGAGGAGGACCCT-3′

怎么會是這樣呢？紫云一臉錯愕，掩面沖出辦公室，跟呆立在門外的水仙芝撞了一個滿懷。兩人先是一驚，不覺同時笑起來了。

Osx-Cre primer reverse:5′-GCCAGGCAGGTGCCTGGACAT-3′

TSC1 loxP primer up：5′-GTC ACG ACC GTA GGA GAA GC-3′

TSC1 loxP primer down：5′-GAA TCA ACC CCA CAG AGC AT-3′

反應(yīng)體系的配置如下：

2×PCR mix10 μl上游引物 02 μl下游引物02 μl超純水02 μlDNA模板04 μl總體積20 μl

PCR反應(yīng)程序：

Col2a1-Cre程序：①94℃ 3 min；②94℃ 40sec；③ 65℃ 40sec；④72℃ 1 min；⑤72℃ 2 min；⑥10℃ hold。②到④為循環(huán)反應(yīng)，循環(huán)數(shù)為37

TSC1 loxP程序：①94℃ 3 min；②94℃ 40sec；③65℃ 1 min；④72℃ 1 min；⑤72℃ 2 min；⑥04℃ hold。②到④為循環(huán)反應(yīng)，循環(huán)數(shù)為35

Osx-Cre程序：①94℃ 2 min；②94℃ 30sec；③60℃ 30sec；④72℃ 30sec；⑤72℃ 2 min；⑥04℃ hold。②到④為循環(huán)反應(yīng)，循環(huán)數(shù)為35

Prx-1-Cre程序：①94℃ 3 min；②94℃ 30sec；③60℃ 1 min；④72℃ 1 min；⑤72℃ 2 min；⑥04℃ hold。②到④為循環(huán)反應(yīng)，循環(huán)數(shù)為35

瓊脂糖凝膠電泳鑒定基因：吸取7-8 μl樣品加入瓊脂糖凝膠上樣孔中，常溫下恒壓160V 電泳約15-20 min，紫外投射儀下觀察并拍照。

1.2.3免疫組化 在出生后8周處死小鼠后取脛腓骨標本，固定并用石蠟包埋后，制作成石蠟切片，收集的新鮮組織標本石蠟切片，進行一抗p-S6過夜孵育，二抗37度孵育1 h，DAB顯色觀察。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)基因小鼠大體外觀及體長分析

各轉(zhuǎn)基因小鼠繁殖比較順利，均獲得相應(yīng)的帶Cre的TSC1純合小鼠。Prx-1-TSC1 CKO組與Con組相比，Prx-1-TSC1 CKO組小鼠瘦小。Col2a1-TSC1 CKO組與Con組相比，Col2a1-TSC1 CKO組小鼠弓形駝背。Osx-TSC1 CKO組與Con組相比，Osx-TSC1 CKO組呈方顱畸形(圖1)。

A為轉(zhuǎn)基因小鼠繁殖策略；B為8周齡大小鼠的大體外觀。(放大倍數(shù)為10X和40X)

2.2 轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定分析

RT-PCR實驗基因鑒定結(jié)果：圖2為出生后3周各小鼠的基因鑒定結(jié)果。1號為帶Prx-1-Cre的TSC1flox/ flox純合子；2號為不帶Prx-1-Cre的TSC1flox/flox純合子；3號為不帶Prx-1-Cre的TSC1flox/-雜合子；4號為帶Prx-1-Cre的TSC1flox/-雜合子；5號、6號為不帶Col2a1-Cre的TSC1flox/flox純合子；7號為帶Col2a1-Cre的TSC1flox/-雜合子；8號為帶Col2a1-Cre的TSC1flox/flox純合子；9號、11號為帶Osx-Cre的TSC1flox/-雜合子；10號為帶Osx-Cre的野生型小鼠；12號為帶Osx-Cre的TSC1flox/flox純合子。

圖2 小鼠基因DNA及Cre重組酶的PCR鑒定結(jié)果

RT-PCR實驗結(jié)果顯示：TSC1-loxP的PCR產(chǎn)物為230 bp和193 bp，TSC1純合子只有230 bp條帶，野生型小鼠則只有193 bp條帶，而雜合子則有230 bp和193 bp 條帶。Prx-1-Cre的PCR產(chǎn)物為550 bp條帶，Col2a1-Cre的PCR產(chǎn)物為358 bp條帶，Osx-Cre的PCR產(chǎn)物為430 bp條帶(圖2)。

2.3 轉(zhuǎn)基因小鼠軟骨與骨組織的免疫組化分析

取8周齡大的小鼠膝關(guān)節(jié)進行免疫組化p-S6染色。Prx-1-TSC1 CKO組與Con組相比，其p-S6的主要表達位置集中在關(guān)節(jié)軟骨面的軟骨細胞和軟骨下骨骨小梁的成骨細胞，而且明顯升高。Col2a1-TSC1 CKO組與Con組相比，其p-S6的主要表達位置集中在關(guān)節(jié)軟骨面的軟骨細胞，而且明顯升高。Osx-TSC1 CKO組與Con組相比，其p-S6的主要表達位置集中在髓腔骨小梁的成骨細胞，而且明顯升高(*，P<0.05；**，P<0.01)(圖3)。

3 討論

正常情況下，骨骼發(fā)育過程是需要多種細胞參與，如間充質(zhì)干細胞、軟骨細胞、成骨細胞等。其中間充質(zhì)干細胞早期可分化成肢芽干細胞，在骨骼形成中有著密切關(guān)系，是修復骨缺損的重要細胞來源。軟骨內(nèi)成骨的過程中，間充質(zhì)細胞或者肢芽干細胞形成致密體，致密體內(nèi)細胞分化為軟骨細胞，然后軟骨細胞開始停止增殖，表達肥大軟骨細胞特異性表達的X型膠原，后分化為成骨細胞，使之分泌骨基質(zhì)，最終形成骨領(lǐng)[4]。在此過程中，如肢芽干細胞發(fā)育異常，則直接影響骨骼發(fā)育，導致身體機能嚴重受限。如軟骨細胞發(fā)育異常，則發(fā)生軟骨發(fā)育不全，導致侏儒癥或者骨關(guān)節(jié)炎[5]。如成骨細胞發(fā)育異常，則發(fā)生骨質(zhì)疏松癥或者脆骨病等[6]。mTOR是一個調(diào)節(jié)細胞生長與代謝的信號通路，參與調(diào)節(jié)蛋白合成、細胞生長、分化、增殖及凋亡[7,8]。其對骨骼發(fā)育的重要作用[9]已逐漸成為研究的熱點。但是，大多數(shù)的研究結(jié)果均得不到一致的結(jié)果，甚至互相矛盾，對其發(fā)育機制仍有爭議。有些觀點認為，mTOR信號通路是促進成骨分化[10]；而黃彬[11]等認為，mTOR信號通路是促進成骨增殖，抑制成骨分化。在我們的研究中，不管在軟骨細胞，還是成骨細胞，Con組小鼠的mTOR活性均比Prx-1-TSC1 CKO組、Col2a1-TSC1 CKO組、Col2a1-TSC1 CKO組小鼠明顯降低，說明在正常情況骨發(fā)育過程下，mTOR活性保持低表達；而mTOR活性高表達，則引起相應(yīng)的骨骼疾病，如侏儒癥、方顱畸形等。因此，從肢芽干細胞、軟骨細胞、成骨細胞上探討mTOR信號將成為結(jié)果骨骼發(fā)育異常的新策略。

Cre/loxP系統(tǒng)是目前應(yīng)用較多的基因敲除模型，在國內(nèi)外已經(jīng)得到廣泛推廣。該系統(tǒng)主要由Cre重組酶和loxP位點組成，Cre重組酶具有一定的催化活性，并且與限制酶有一定相似之處，能識別特定的DNA序列，如loxP位點，引起內(nèi)外源基因敲除、失活、激活、插入、倒轉(zhuǎn)、易位等[12,13]。在肢芽干細胞、軟骨細胞、成骨細胞上敲除TSC1基因，將有望構(gòu)建肢芽干細胞、軟骨細胞、成骨細胞mTOR活性激活的轉(zhuǎn)基因小鼠，對研究骨骼發(fā)育異常提供良好的動物模型。按照轉(zhuǎn)基因繁殖方法[14]，我們得到了相應(yīng)的Prx-1-TSC1 CKO組、Col2a1-TSC1 CKO組和Col2a1-TSC1 CKO組小鼠各8只，其敲除效果明顯： Prx-1-TSC1 CKO組集中在關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨骨小梁；Col2a1-TSC1 CKO組，集中在關(guān)節(jié)軟骨，引起脊柱弓形駝背；Osx-TSC1 CKO組，集中在髓腔骨小梁，引起方顱畸形。

圖3 轉(zhuǎn)基因小鼠的p-S6分布結(jié)果

A為Prx-1-TSC1 CKO組與Con組小鼠的關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨p-S6的表達，B、C分別為其關(guān)節(jié)軟骨、骨小梁p-S6表達統(tǒng)計分析；D為Col2al-TSC1 CKO組與Con組小鼠的關(guān)節(jié)軟骨p-S6的表達，E為其關(guān)節(jié)軟骨p-S6表達統(tǒng)計分析。F為Osx-TSC1 CKO組與Con組小鼠的髓腔骨小梁p-S6的表達，G為其骨小梁p-S6表達統(tǒng)計分析。(放大倍數(shù)為200X和400X)

綜上所述，本實驗中成功構(gòu)建了肢芽干細胞、軟骨細胞、成骨細胞特異性敲除TSC1轉(zhuǎn)基因小鼠，首次從骨骼發(fā)育各階段中繁殖出相應(yīng)的mTOR活性激活小鼠，為進一步探討骨骼發(fā)育缺陷提供新的研究靶點和新認識，為臨床骨科相關(guān)疾病提供新的理論基礎(chǔ)。