孔祥怡，杜建時，叢樂樂，趙 晴

(吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院 1.血管外科；2.皮膚科；3.南湖院區(qū)神經(jīng)內(nèi)科，吉林 長春130033)

阿爾茨海默病(AD)是癡呆綜合征最常見的一種，老年人多發(fā)，其特征在于不可逆的記憶喪失和認知能力下降[1]，臨床表現(xiàn)為進行性記憶障礙、視空間技能損害、執(zhí)行功能障礙、人格和行為改變等，是60%-70%的老年癡呆癥的潛在原因[2]。阿爾茨海默病的發(fā)病機制非常復(fù)雜，可能與遺傳、環(huán)境密切相關(guān)[3]，而基因的甲基化作為作為其發(fā)病機制的一個部分，在阿爾茨海默病的起病過程中起著不可忽視的作用[4,5]。OPRK1作為阿片類受體基因，在人類的記憶、學習過程發(fā)揮重要作用，該基因的甲基化依靠調(diào)控基因表達促使阿爾茨海默病發(fā)病。本實驗通過探討外周血中OPRK1基因啟動子區(qū)甲基化與AD發(fā)病風險的相關(guān)性，為阿爾茨海默病患者的早期診斷及治療提供指導(dǎo)意見。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1研究對象 所有病例均取自2015年10月-2017年12月吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院認知功能障礙門診及神經(jīng)內(nèi)一科病房收入院的患者，AD組為老年阿爾茨海默病患者，同時選取我科門診就診患者既往無重大疾病，目前無急癥的非AD患者為對照組。研究對象共例AD組45例，對照組55例。此項目已在我院倫理委員會批準立項，入組患者對項目知情并簽署知情同意書，兩組間基線資料對比無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。納入標準：全部患者符合美國精神病學會的精神障礙診斷和統(tǒng)計手冊第4修訂版(DSM-IV)中AD的診斷標準；排除標準：(1)合并其他類型癡呆的患者，(2)患有嚴重原發(fā)性疾病患者，(3)有精神病史患者，有腦卒中、頭外傷患者。

1.1.2標本收集 EDTA管留取患者清晨空腹血樣，3 000 g×10 min離心，小心吸取中間白細胞層，編號，-80℃保存樣本。

1.2 方法

應(yīng)用Wizard Genomic DNA Purification Kit試劑盒，嚴格按照說明書進行DNA的提取。采用EpiTect Fast DNA Bisulfite Kit試劑盒，(購于德國Qiagen公司)，嚴格按照試劑盒說明書進行DNA的亞硫酸氫鹽處理。以亞硫酸氫鹽處理后的DNA模板為樣本，利用甲基化及非甲基化引物通過PCR擴增儀進行擴增?？偡磻?yīng)體系25 μl，DNA模板1 μl，EpiTect Master Mix12.5 μl，RNase-free water 10.5 μl，甲基化及非甲基化引物各0.5 μl。PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性10 min，94℃變性15 s，55℃退火30 s，共40個循環(huán)，最后72℃延伸10 min，4℃

保存，取5 μl PCR產(chǎn)物、1 μl Loading Buffer，通過綠如藍核酸染料進行染色，在3.0%瓊脂糖凝膠中上樣，120V電泳，在全自動凝膠成像系統(tǒng)GelDocXR+下顯像。OPRK1基因以甲基化引物(M)出現(xiàn)產(chǎn)物條帶判斷為陽性，非甲基化引物(U)出現(xiàn)產(chǎn)物條帶判斷為陰性，當甲基化引物出現(xiàn)產(chǎn)物條和非甲基化引物同時出現(xiàn)產(chǎn)物條帶判斷為陽性。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件處理對計量資料進行方差齊性檢驗，相關(guān)性分析采用χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 OPRK1基因甲基化結(jié)果

AD組OPRK1基因啟動子區(qū)甲基化率明顯高于對照組，經(jīng)統(tǒng)計學分析，兩者比較，χ2值=22.37，P<0.05，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 OPRK1基因甲基化結(jié)果

注：χ2=22.37；P<0.05.

2.2 MSP擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖

圖1.1示：AD組U出現(xiàn)產(chǎn)物條帶，部分M出現(xiàn)產(chǎn)物條帶；圖1.2為對照組，M及U均出現(xiàn)產(chǎn)物條帶，既存在甲基化改變，又存在非甲基化改變。

注：Marker:2000 bp DNA； U:unmethylation ； M:methylation

3 討論

脫氧核糖核酸甲基化是基因調(diào)控常見的表觀遺傳學之一，脫氧核糖核酸甲基化是將胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?-甲基胞嘧啶的一種反應(yīng)[6]。表觀遺傳修飾包含脫氧核糖核酸甲基化、組蛋白修飾和微小核糖核酸。甲基化能夠影響脫氧核糖核酸與蛋白質(zhì)相互作用方式，進而改變基因的表達形式[7,8]，不同基因的甲基化可能從多方面影響癡呆的發(fā)生。

OPRK1基因編碼阿片受體，基因發(fā)生甲基化與阿爾茨海默病的發(fā)病可能有一定的關(guān)系，被認為是治療神經(jīng)疾病的藥物靶點，在認知障礙的發(fā)生過程中起著關(guān)鍵作用[9]。阿片受體主要分布在海馬區(qū)域[10]，它利用神經(jīng)保護作用，減少β-淀粉樣蛋白的生成，影響阿爾茨海默病的發(fā)病[11,12]。隨著老齡化社會的到來，阿爾茨海默病的人群患病率逐年上升，阿爾茨海默病的發(fā)病機制至今仍很不明確，早期的診斷尤為困難，給患者本人、家庭、社會帶來了沉重的負擔，所以對阿爾茨海默病發(fā)病機制探索，從分子生物學水平有大量的研究證明，阿爾茨海默病的發(fā)病與脫氧核糖核酸甲基化密切相關(guān)[13]。

脫氧核糖核酸的甲基化可能造成神經(jīng)退行性疾病發(fā)生，本次研究中，阿爾茨海默病組的基因甲基化率明顯高于健康對照組，OPRK1基因啟動子區(qū)發(fā)生甲基化改變阿爾茨海默病組的患者檢測出共有31(68.89%)例患者，而在健康對照組中只有12(21.82%)例患者發(fā)生改變，JiHuihui等人也作出了同樣的結(jié)果[14]。性別是阿爾茨海默病發(fā)病風險的一個重要因素，有研究表明基因組甲基化在男、女之間有一定的區(qū)別[15]，本次研究顯示阿爾茨海默病OPRK1基因甲基化與男女性別無相關(guān)性，這個結(jié)果可能需要更多的實驗研究闡明性別對表觀遺傳變化的影響，基于分子、細胞和小鼠動物模型等多個層次系統(tǒng)的研究都取得了豐碩的成果[16]。

目前，隨著基因檢測技術(shù)的不斷進步，與阿爾茨海默病發(fā)病相關(guān)的易感基因的甲基化狀態(tài)被逐漸被人類發(fā)現(xiàn)，可以在早期發(fā)現(xiàn)這些易感基因的改變，從而建立一個易感基因譜，為疾病的早期診斷、早期治療提高科學的依據(jù)。