劉 佳 陳少壯* 馬 駿 葉巖榮 蔡定芳 符茂東 羅艾君 姜維文

（復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院廈門醫(yī)院，福建 廈門 510530）

缺血性腦中風(fēng)（IBS）是以腦組織缺血缺氧損傷及相應(yīng)神經(jīng)功能病變體征為主要臨床表現(xiàn)的腦血管病，多年來(lái)臨床尚缺乏有效治療藥物[1]。且梗死位置及體積相似的患者長(zhǎng)期預(yù)后的神經(jīng)功能恢復(fù)卻并不一致，這提示神經(jīng)功能恢復(fù)并非僅與灰質(zhì)相關(guān)[2]。

白質(zhì)由神經(jīng)元軸突、髓磷脂蛋白及多種膠質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成，IBS引起缺血缺氧損傷，繼發(fā)膠質(zhì)細(xì)胞壞死、髓磷脂蛋白脫失降解，影響神經(jīng)功能。損傷后，機(jī)體產(chǎn)生少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞（OPCs）遷移至脫髓鞘區(qū)域，促進(jìn)髓鞘再生，但該修復(fù)能力有限[3]；而小膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞免疫細(xì)胞，可被激活成兩種表型：M1型釋放炎性因子，造成繼發(fā)性的白質(zhì)損傷[4]；M2型可吞噬、清理壞死細(xì)胞碎片，釋放生長(zhǎng)因子促進(jìn)細(xì)胞再生和分化成熟[5-6]。

銀杏葉主要成分銀杏內(nèi)酯B（GB）是活性最強(qiáng)的血小板活化因子（PAF）抑制劑，前人研究主要聚焦于抗炎作用：抗血栓形成[7]；抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷[8]；抑制急性腦缺血炎性反應(yīng)，改善急性期神經(jīng)功能[9]。而脊髓損傷模型中，PAF作為GB的靶點(diǎn)，可誘導(dǎo)原本向少突膠質(zhì)細(xì)胞分化的前體膠質(zhì)細(xì)胞向星性膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化[10]，引起反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生；而阻斷PAF及其下游通路后，可明顯縮小膠質(zhì)瘢痕，并改善動(dòng)物神經(jīng)功能[11]。這提示GB可能參與了髓鞘修復(fù)過(guò)程，本文旨在從白質(zhì)修復(fù)角度進(jìn)一步驗(yàn)證GB的神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組：清潔級(jí)成年雄性C57/BL6小鼠（上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司），8～10周齡，24～28 g，隨機(jī)分為假手術(shù)組（sham組），對(duì)照組（MCAO+PBS，簡(jiǎn)稱PBS組），實(shí)驗(yàn)組（MCAO+GB，簡(jiǎn)稱GB組）。1.2 成年小鼠大腦中動(dòng)脈栓塞（MCAO）模型制備[7]：動(dòng)物麻醉后切開頸部，頸外動(dòng)脈處剪一小口，放入線栓（硅膠頭直徑0.22～0.23 cm），離斷頸外動(dòng)脈，沿頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈進(jìn)線栓直至大腦中動(dòng)脈起始部，檢測(cè)腦血流確認(rèn)中動(dòng)脈血流下降至術(shù)前的80%以上，阻斷60 min，拔出線栓。

1.3 腦室立體定位植入注射套管和滲透壓泵：術(shù)前1 d，將膠囊式滲透壓微量注射泵（alzet?，容積100 μL，泵藥速率0.5 μL/h，持續(xù)給藥7 d） 裝入液體：PBS組為100 μL PBS溶液；GB組為GB濃度為5 ng/μL的100 μL PBS溶液。將微量注射套管（alzet?）與滲透壓泵組合。MCAO后1 d使用立體定位儀將微量注射套管垂直向下植入麻醉小鼠損傷對(duì)側(cè)腦室區(qū)（前囟后0.20 mm，右側(cè)旁開1.00 mm），后將與套管相連的膠囊式滲透壓泵埋藏于小鼠背部皮下，生物膠黏合套管與顱骨。為確保泵內(nèi)藥物的完全注射，第9天行氣麻下滲透壓泵取出+導(dǎo)管封堵術(shù)。

1.4 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)：錯(cuò)步實(shí)驗(yàn)：計(jì)數(shù)小鼠在含有2 cm×2 cm小柵欄的不銹鋼架上右側(cè)肢體錯(cuò)步率（錯(cuò)步數(shù)/總步數(shù)×100%）。轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)：記錄小鼠轉(zhuǎn)棒儀器（5 min內(nèi)加速到40轉(zhuǎn)/分后恒速運(yùn)轉(zhuǎn)）上的運(yùn)動(dòng)時(shí)間。共3次，間隔15 min。

1.5 組織冰凍切片制備：麻醉小鼠后左心室依次灌注生理鹽水、4%PA液后取腦固定，6 h后依次移入梯度蔗糖磷酸緩沖液脫水。使用恒冷箱切片機(jī)做冠狀切片，厚度為25 μm，-20 ℃原位雜交保護(hù)液中保存。

1.6 免疫組織化學(xué)染色：PBS漂洗腦片；破膜劑孵育20 min；漂洗；含10%山羊血清的PBS孵育1 h封閉抗原；含1%山羊血清的PBST液中加入一抗，室溫中孵育1 h，4度冰箱過(guò)夜；漂洗；含1%山羊血清的PBST溶液中加入熒光標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h；漂洗；貼片封片。1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析：使用SPSS 16.0軟件處理數(shù)據(jù)，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（x-±s）表示。使用單因數(shù)方差分析差異，P＜0.05為顯著性臨界值。

2 結(jié) 果

2.1 MCAO后腦室注射GB可促進(jìn)遠(yuǎn)期神經(jīng)功能恢復(fù)：將PBS組、GB組制作MCAO動(dòng)物模型模擬缺血性腦中風(fēng)，Sham租行假手術(shù)。前兩組術(shù)后第1天植入、第9天取出藥物滲透壓泵（方法見前文）。前期預(yù)試驗(yàn)明確GB給藥濃度為5 ng/μL（見討論）。MCAO后第9天，隨機(jī)選取6只小鼠腦片，右側(cè)腦室背側(cè)胼胝體均可見針道穿透處，且腦室無(wú)明顯擴(kuò)大（圖1A），提示定位準(zhǔn)確，藥物能夠注射入腦室內(nèi)；GB劑量可代謝，無(wú)交通性腦積水等并發(fā)癥。

造模前予行為學(xué)訓(xùn)練，MCAO術(shù)后第3、5、7、14、21、28、35天行行為學(xué)測(cè)試。錯(cuò)步實(shí)驗(yàn)（圖1B），轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)（圖1C）提示：MCAO造成小鼠運(yùn)動(dòng)功能受損，后患肢的錯(cuò)步率顯著增加，轉(zhuǎn)棒時(shí)間減少，均持續(xù)至術(shù)后35 d；而GB治療后，小鼠神經(jīng)功能損傷顯著改善，在術(shù)后21天錯(cuò)步率顯著降低（P＜0.01），轉(zhuǎn)棒時(shí)間延長(zhǎng)，術(shù)后14 d時(shí)顯著高于PBS組（P＜0.01）。這提示GB能促進(jìn)MCAO后遠(yuǎn)期神經(jīng)功能恢復(fù)。

2.2 GB能促進(jìn)MCAO后梗死周邊白質(zhì)修復(fù)：筆者從白質(zhì)修復(fù)角度進(jìn)行探討。MBP是成熟的髓鞘內(nèi)表達(dá)的特異性蛋白，脫髓鞘病變中會(huì)脫失；SMI-32 是非磷酸化神經(jīng)絲的特異性蛋白，髓鞘損傷后可暴露。MBP/SMI-32提示白質(zhì)修復(fù)程度。選取MCAO后35 d的腦片，共同標(biāo)記MBP與SMI-32，在周邊區(qū)皮層（CTX）、胼胝體（CC）、紋狀體（STR）區(qū)（圖2A、B）對(duì)MBP/SMI-32熒光強(qiáng)度比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（圖3C），提示：MCAO造成該比值降低，而GB治療后該值明顯增高（P＜0.05），證實(shí)GB能促進(jìn)梗死周邊區(qū)白質(zhì)髓鞘蛋白的修復(fù)。

綜上，GB能明顯改善MCAO引起的長(zhǎng)期神經(jīng)功能的缺損，而GB對(duì)髓鞘的修復(fù)作用參與了神經(jīng)功能的恢復(fù)。

圖1 MCAO后腦室注射GB可改善遠(yuǎn)期神經(jīng)功能。（A）給藥套管定位示意圖。紅色星號(hào)指示套管穿透損傷區(qū)對(duì)側(cè)胼胝體，到達(dá)側(cè)腦室。（B）右后肢錯(cuò)步率。（B） 轉(zhuǎn)棒持續(xù)時(shí)間。*P＜0.05，**P＜0.01，GB組&PBS組；# P＜0.05，##P＜0.01，PBS組&Sham組

圖2 GB治療能夠促進(jìn)MCAO后35 d時(shí)周邊區(qū)皮層、胼胝體、紋狀體白質(zhì)髓鞘蛋白的修復(fù)。*P＜0.05，GB組&PBS組；##P＜0.01，PBS組&Sham組

3 討 論

本研究側(cè)重探究MCAO后GB的神經(jīng)保護(hù)作用及其白質(zhì)修復(fù)機(jī)制。但GB在體給藥的藥代動(dòng)力學(xué)及外周不良反應(yīng)尚需進(jìn)一步研究。GB濃度10 ng/μL腦室給藥至第9天，取腦切片發(fā)現(xiàn)腦室明顯擴(kuò)大，提示高濃度性腦積水，濃度減為5 ng/μL后腦室形態(tài)正常，故采用該濃度進(jìn)行研究。同時(shí)，PBS組錯(cuò)步率緩慢下降，而GB治療組第14天時(shí)錯(cuò)步率一過(guò)性升高（圖1B），這可能由于GB突然撤藥引起了“反跳現(xiàn)象”，提示GB最好緩慢停藥。而對(duì)于GB治療MCAO的給藥劑量、速度、濃度仍需進(jìn)一步細(xì)致的研究。

其次，GB修復(fù)白質(zhì)的機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。前人研究表明GB體外可促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型激活，而后者能吞噬脫髓鞘碎片，而前期離體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，M2型小膠質(zhì)細(xì)胞與OGD損傷的OPCs共培養(yǎng)后，能夠促進(jìn)OPCs分化成熟，提高M(jìn)BP的表達(dá)[7,10]。這可能是GB白質(zhì)修復(fù)的重要機(jī)制。

綜上，本研究從白質(zhì)修復(fù)相關(guān)的神經(jīng)保護(hù)角度出發(fā)，肯定了腦室給藥在缺血性腦中風(fēng)后治療效果，同時(shí)發(fā)現(xiàn)腦室注射GB促進(jìn)損傷后的白質(zhì)修復(fù)，為缺血性腦中風(fēng)臨床藥物治療提供了新思路，使GB受體相關(guān)信號(hào)通路成為介導(dǎo)白質(zhì)修復(fù)的重要靶點(diǎn)，為今后腦損傷后白質(zhì)修復(fù)作用及機(jī)制的研究提供了更廣闊的研究空間。