王耀宗 孫乃坤 葉桂峰 楊鑌 張英

(廈門大學(xué) 1附屬中山醫(yī)院骨科，福建 廈門 361003；2附屬第一醫(yī)院脊柱外科)

骨肉瘤(OS)也稱為成骨肉瘤，是一種常見的原發(fā)性成骨性實(shí)體惡性腫瘤，約占所有惡性腫瘤發(fā)生率的2.4%〔1，2〕。據(jù)報(bào)道，超過30%的OS患者可出現(xiàn)癌細(xì)胞肺、胸膜和心臟轉(zhuǎn)移，極大程度上加大了OS的治療難度，導(dǎo)致患者5年生存率僅為40%～75%〔3，4〕。目前，臨床中常采用放療、化療、手術(shù)切除治療，但對(duì)轉(zhuǎn)移性或復(fù)發(fā)性O(shè)S患者治療效果不理想，極易產(chǎn)生不良預(yù)后〔5，6〕。

LncRNAs是一類超過200個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的長(zhǎng)鏈非蛋白編碼RNAs，最早被認(rèn)為是基因轉(zhuǎn)錄的“噪音”，但近年來研究表明，部分lncRNAs可通過再轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)參與機(jī)體內(nèi)多種生物學(xué)過程，如細(xì)胞周期、分化、增殖、凋亡等〔7〕。研究證實(shí)，在多種癌癥組織或細(xì)胞中均出現(xiàn)lncRNAs的異常表達(dá)，失調(diào)的lncRNAs通過調(diào)控腫瘤相關(guān)因子表達(dá)發(fā)揮致癌或腫瘤抑制作用〔8〕。生長(zhǎng)停滯特異性轉(zhuǎn)錄因子(GAS)5是最早在小鼠生長(zhǎng)停滯的成纖維細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)的lncRNA，定位于人染色體1q25.1上。大量研究顯示，該lncRNA在多種人類腫瘤中發(fā)揮重要的腫瘤抑制作用〔9～11〕，但其在OS發(fā)展中的功能和機(jī)制還有待深入研究。本研究分析GAS5在OS細(xì)胞中的表達(dá)及對(duì)OS細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，并深入探究GAS5調(diào)控細(xì)胞功能的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1材料 細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)于2017年6月至2018年3月在廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院病理科完成。人胚胎腎細(xì)胞293T和人成骨細(xì)胞hFOB 1.19(中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù))；OS細(xì)胞U2OS(美國(guó)ATCC)；胎牛血清，DMEM培養(yǎng)基，McCoy 5A培養(yǎng)基，胰蛋白酶(美國(guó)Gibco)；Lipofectamine 2000 Reagent,High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit,MicroRNA Reverse Transcription Kit,Maxima SYBR Green qPCR Master Mix(2×)(美國(guó)ThermoFisher),Dual-Luciferase? Reporter Assay System(美國(guó)Promega)；點(diǎn)突變?cè)噭┖?日本Takara)；Transwell細(xì)胞小室(孔徑8 μm)(美國(guó)Corning)；Matrigel基底膜基質(zhì)(美國(guó)BD Biocoat)；噻唑藍(lán)(MTT)細(xì)胞增殖試劑盒、總RNA提取試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；pcDNA-GAS5重組質(zhì)粒(GAS5)及對(duì)照質(zhì)粒(pcDNA3.1)，GAS5小干擾RNA(si-GAS5)及干擾對(duì)照(si-NC),miR-221模擬物(miR-221)及相應(yīng)的陰性對(duì)照(miR-NC),miR-221抑制劑(anti-miR-221)及相應(yīng)的陰性對(duì)照(anti-miR-NC),含miR-221結(jié)合位點(diǎn)的野生型GAS5熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒(GAS5-WT)和miR-221結(jié)合位點(diǎn)突變的突變型GAS5熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒(GAS5-MUT,上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 293T和hFOB 1.19細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，U2OS細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的McCoy 5A培養(yǎng)基中。將上述細(xì)胞置于37℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2 d更換一次培養(yǎng)基，至細(xì)胞融合度達(dá)85%時(shí)，進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將上述處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于6孔板中，過夜培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)50%時(shí)，利用Lipofectamine 2000將上述質(zhì)?；蚬押塑账徂D(zhuǎn)染到細(xì)胞中，持續(xù)培養(yǎng)48 h后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。

1.4qRT-PCR檢測(cè)GAS5和miR-221表達(dá) 利用總RNA提取試劑盒提取細(xì)胞中的總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度后分別利用High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit和MicroRNA Reverse Transcription Kit將GAS5和miR-221逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。miR-221-RT：AGCUACAUUGUCUGCUGGGUU-UC；U6-RT：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTGCACTGGATACGACAAAATAGTGAAC。以cDNA為模板，利用Maxima SYBR Green qPCR Master Mix(2×)配制qPCR反應(yīng)體系，之后在熒光定量PCR儀上測(cè)定GAS5和miR-221的相對(duì)表達(dá)水平，分別以GAPDH和U6 snRNA作為內(nèi)參，結(jié)果按照2-ΔΔCt公式計(jì)算。GAS5上游引物：5′-CTTCTGGGCTCAAGTGATCCT-3′，下游引物：5′-TTGTGCCATGAGACTCCATCAG-3′；GAPDH上游引物：5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游引物：5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′；miR-221上游引物：5′-CAGCATACATGAT TCCTTGTGA-3′，下游引物：5′-CTTTGGTGTTTGAGATGTTTGG-3′；U6上游引物：5′-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3′，下游引物：5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′。

1.5MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性 將轉(zhuǎn)染后的U2OS細(xì)胞以3×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)樣品，分別在轉(zhuǎn)染后24、48、72 h加入MTT試劑，37℃、5% CO2條件下孵育4 h后，加入Formazan溶解液，之后在酶標(biāo)儀上測(cè)定570 nm處的吸光值。

1.6Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞侵襲和遷移 細(xì)胞遷移：將轉(zhuǎn)染48 h后的U2OS細(xì)胞用0.25%的胰酶消化，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，用不含血清的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞密度為5×105/ml。取200 μl細(xì)胞懸液加入24孔板小室上室中，在下室內(nèi)加入500 μl含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)48 h后取出，用棉簽擦去上室內(nèi)的細(xì)胞，之后用0.1%結(jié)晶紫染液染色10 min，倒置顯微鏡下觀察結(jié)果并拍照，隨機(jī)選取10個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，并計(jì)算平均遷移細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)需要在上室中加入Matrigel以模仿細(xì)胞外基質(zhì)，具體操作步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.7雙熒光素酶報(bào)告分析 利用Lipofectamine 2000將構(gòu)建的GAS5-WT/MUT重組質(zhì)粒與miR-NC、miR-221、anti-miR-NC或anti-miR-221共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，48 h后利用Dual-Luciferase?Reporter Assay System檢測(cè)各組細(xì)胞的熒光素酶活性。

1.8主要觀察指標(biāo) GAS5在OS細(xì)胞中的表達(dá)；GAS5對(duì)OS細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及調(diào)控機(jī)制。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析及SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1GAS5在OS細(xì)胞U2OS中的表達(dá) 與正常hFOB 1.19組(1.008±0.002)相比，U2OS細(xì)胞中GAS5相對(duì)表達(dá)量(0.297±0.035)顯著降低(P<0.05)。

2.2GAS5過表達(dá)對(duì)U2OS細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響 GAS5轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中GAS5相對(duì)表達(dá)水平(3.251±0.326)顯著高于pcDNA轉(zhuǎn)染組(1.025±0.025，P<0.05)，說明通過轉(zhuǎn)染GAS5可建立GAS5過表達(dá)細(xì)胞模型。與pcDNA組相比，GAS5過表達(dá)的U2OS細(xì)胞在48 h和72 h的增殖活性明顯降低(P<0.05)；GAS5轉(zhuǎn)染后48 h，U2OS細(xì)胞的遷移和侵襲活性也明顯低于pcDNA轉(zhuǎn)染組(P<0.05)，見圖1，表1。

圖1 GAS5過表達(dá)抑制U2OS細(xì)胞遷移和侵襲

組別吸光度值24 h48 h72 h遷移數(shù)目(個(gè))侵襲數(shù)目(個(gè))pcDNA組0.202±0.0180.575±0.0250.916±0.05296.23±10.05109.54±10.21GAS5組0.211±0.023 0.337±0.0311) 0.448±0.0361)43.18±6.131)50.26±5.481)

與pcDNA組比較：1)P<0.05

2.3GAS5與miR-221靶向關(guān)系驗(yàn)證 miR-221序列中存在與GAS5互補(bǔ)結(jié)合的位點(diǎn)，GAS5：5′-gauAUUCUGCAUUCCCAUGUAGCa-3′，miR-221:3′-cuuUGGGUCGU-CUGUUACAUCGa-5′。與miR-NC組相比，miR-221過表達(dá)明顯抑制GAS5-WT的熒光素酶活性(P<0.05)，但對(duì)GAS5-MUT熒光素酶活性無影響(P>0.05)；與anti-miR-NC組相比，抑制miR-221表達(dá)明顯促進(jìn)了GAS5-WT的熒光素酶活性(P<0.05)，但對(duì)GAS5-MUT熒光素酶活性無影響(P>0.05)，見表2。

表2 miR-221過表達(dá)或敲低對(duì)GAS5WT/MUT報(bào)告質(zhì)粒熒光素酶活性的影響

與miR-NC組比較：1)P<0.05；與anti-miR-NC組比較：2)P<0.05

2.4GAS5對(duì)miR-221表達(dá)的調(diào)控 與pcDNA組(1.015±0.002)相比，GAS5轉(zhuǎn)染的U2OS細(xì)胞中miR-221的相對(duì)表達(dá)量(0.248±0.014)顯著降低(P<0.05)；與si-NC組(0.986±0.013)相比，si-GAS5轉(zhuǎn)染的U2OS細(xì)胞中miR-221相對(duì)表達(dá)量(2.863±0.205)顯著升高(P<0.05)。

2.5miR-221在OS細(xì)胞U2OS中的表達(dá) 與正常hFOB 1.19組(1.000±0.003)相比，U2OS細(xì)胞中miR-221的相對(duì)表達(dá)量(3.213±0.033)顯著升高(P<0.05)。

2.6miR-221逆轉(zhuǎn)GAS5對(duì)U2OS細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用 與GAS5+miR-NC組相比，外源回補(bǔ)miR-221可顯著逆轉(zhuǎn)GAS5對(duì)U2OS細(xì)胞增殖的抑制作用(P<0.05)；與GAS5+miR-NC組相比，外源回補(bǔ)miR-221可逆轉(zhuǎn)GAS5對(duì)U2OS細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用(P<0.05)，見表3。

組別吸光度值24 h48 h72 h遷移數(shù)目(個(gè))侵襲數(shù)目(個(gè))pcDNA組0.213±0.0240.596±0.0551.037±0.176110.45± 12.39123.32± 12.68GAS5組0.208±0.0320.367±0.0411)0.492±0.0531)53.71 ± 5.731)63.41 ±6.531)GAS5+miR-NC組0.216±0.0210.343±0.0300.514±0.04458.52 ±6.0453.36 ±6.04GAS5+miR-221組0.227±0.020 0.569±0.0472) 0.936±0.0862)96.46 ±9.482)98.27 ±10.422)

與pcDNA組比較:1)P<0.05；與GAS5+miR-NC組比較:2)P<0.05

3 討 論

新型臨床輔助化療藥物的開發(fā)，極大程度地緩解了OS患者的病情發(fā)展〔12〕，然而，惡性腫瘤轉(zhuǎn)移仍然是導(dǎo)致OS患者治療失敗的主要原因〔13〕。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，研究人員發(fā)現(xiàn)lncRNA在多種生物過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，異常表達(dá)的lncRNA可能涉及多種人類疾病，特別是惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，包括OS〔14，15〕。LncRNA GAS5在多種人類腫瘤中出現(xiàn)異常的低表達(dá)，并通過調(diào)控癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲、細(xì)胞周期和凋亡等過程發(fā)揮腫瘤抑制功能。研究顯示，肝癌組織中低表達(dá)的GAS5可作為患者總體存活率的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，外源過表達(dá)GAS5可通過調(diào)控波形蛋白表達(dá)抑制體外肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲〔16〕；在胰腺導(dǎo)管癌中GAS5表達(dá)水平顯著降低，體外功能實(shí)驗(yàn)證實(shí)，下調(diào)的GAS5可通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶(CDK)6表達(dá)調(diào)控細(xì)胞周期并發(fā)揮對(duì)癌細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用〔17〕。本研究結(jié)果表明，lncRNA GAS5在OS中發(fā)揮腫瘤抑制作用。Ye等〔18〕證實(shí)，GAS5可通過抑制OS細(xì)胞生長(zhǎng)和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化發(fā)揮抗腫瘤形成作用；Wang等〔19〕研究表明，OS細(xì)胞MG-63中下調(diào)的GAS5可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移，并促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1、Cyclin B1、CDK1和CDK4表達(dá)，本研究結(jié)果與之相一致。

研究表明，lncRNA GAS5可發(fā)揮“分子海綿”的功能吸附miRNA，減少miRNA在特定組織或細(xì)胞中的表達(dá)，最終參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展〔20〕。如GAS5可通過與miR-222互補(bǔ)結(jié)合，抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲、遷移和凋亡〔21〕；此外，GAS5還可通過抑制miR-103表達(dá)促進(jìn)其下游靶基因第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(PTEN)水平的升高，進(jìn)而延緩子宮內(nèi)膜癌的發(fā)展〔22〕。本研究結(jié)果證實(shí)miR-221是GAS5的一個(gè)靶miRNA，GAS5能夠通過互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)負(fù)調(diào)控miR-221表達(dá)。miR-221是一種常見的致癌因子，參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。如在胃癌卵巢轉(zhuǎn)移患者血清外泌體中，miR-221表達(dá)水平顯著升高，由此初步說明miR-221可能參與胃癌的卵巢轉(zhuǎn)移過程〔23〕；miR-221/222簇可通過調(diào)控PTEN/蛋白激酶B(Akt)信號(hào)通路活性促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲〔24〕。miR-221通過靶向抑制AT豐富結(jié)合域1A基因(ARID1A)增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力〔25〕。另外，本研究結(jié)果顯示，外源回補(bǔ)miR-221逆轉(zhuǎn)了GAS5對(duì)OS細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用。綜上，GAS5在OS細(xì)胞中表達(dá)量降低，而miR-221表達(dá)量升高；過表達(dá)GAS5可通過靶向吸附miR-221抑制OS細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力，在OS發(fā)展中起腫瘤抑制作用，提示GAS5具有作為OS新型腫瘤抑制劑的潛能。