蔡松濤， 孫京濤， 魏 瑄

(鄭州市骨科醫(yī)院關(guān)節(jié)病二科， 河南 鄭州 450052)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種由于自身免疫調(diào)節(jié)功能紊亂而造成的慢性關(guān)節(jié)疾病，患者關(guān)節(jié)處滑膜細胞出現(xiàn)異常增殖，這種與腫瘤細胞類似的侵蝕性生長會對軟骨組織造成極為的嚴(yán)重破壞，進而導(dǎo)致患者關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)疼痛、畸形以及關(guān)節(jié)的活動受到限制[1-2]?？傮w來說，RA受外界環(huán)境和個人體質(zhì)以及生活習(xí)慣的影響，然而RA的具體發(fā)病機制尚不清楚。

微小RNA(microRNA, miRNA)是一類長度約為22 nt,廣泛存在于真核生物中保守的非編碼RNA，可特異性作用于下游靶基因的3’-UTR區(qū)，降解下游靶基因的mRNA或者阻止靶基因的蛋白翻譯過程，從而發(fā)揮對靶基因的負調(diào)節(jié)機制。研究表明，miRNA可將信號通路中的關(guān)鍵蛋白作為開關(guān)，通過調(diào)控靶基因的活性來影響信號通路的傳遞，從而影響細胞增殖代謝進程[3-4]。miRNA表達水平的異常往往與自身免疫性疾病相關(guān)聯(lián)，在RA患者中多種miRNA表達存在異常，miR-155、miR-499和miR-146a等顯著上調(diào)[5-6]，而miR-22、miR-124a、miR-23b和miR-34a等顯著下調(diào)[7-10]。由此可見，miRNA在RA的病變過程中發(fā)揮著重要作用。通過TargetScan分析可知，RA滑膜成纖維細胞中低表達的miR-23b-3p與X連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein, XIAP)具有靶向關(guān)系，本研究將設(shè)計實驗驗證miR-23b-3p對XIAP的靶向關(guān)系并探究其可能的具體調(diào)控機制，以期為RA新的靶點治療提供參考資料。

材 料 和 方 法

1 實驗材料

人正常關(guān)節(jié)滑膜成纖維細胞及類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細胞購自上海賽百慷公司。胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)液和胰蛋白酶Ⅰ購自Gibco；抗GAPDH、Ki67和Bcl-2抗體以及Ⅱ抗購自Cell Signaling Technology；雙螢光素酶報告基因試劑盒購自Biotium；miR-23b-3p模擬物和抑制物購自上海吉瑪公司；TRIzol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和Lipofectamine 2000試劑盒購自Introvigen；PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix購自Thermo；合成其余分子試劑購于上海生工生物工程公司；流式細胞儀購自Bio-Rad；實時熒光定量PCR儀購自Roche；引物由北京華大基因公司提供。

2 方法

2.1細胞的培養(yǎng) 從液氮中取出細胞置于37 ℃水浴鍋中，待其融化后轉(zhuǎn)入含有DMEM培養(yǎng)液的離心管中，1 500×g離心5 min后去除上清，少量培養(yǎng)液重懸后轉(zhuǎn)入含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，于37 ℃、5%CO2和95%相對濕度條件下靜置培養(yǎng)。

2.2雙螢光素酶報告基因?qū)嶒?設(shè)計并合成含有miR-23b-3p結(jié)合位點的XIAP 3’-UTR正常片段及其突變體，將其插入pMIR-REPORT載體的報告基因下游區(qū)域，獲得含有XIAP的WT-3’-UTR和Mut-3’-UTR的重組質(zhì)粒。使用Lipofectamine 2000將miR-23b-3p模擬物與XIAP的WT-3’-UTR或Mut-3’-UTR重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，48 h后使用雙螢光素酶報告基因試劑盒檢測螢光素酶相對活性，具體參照說明書。

2.3細胞的轉(zhuǎn)染 取狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細胞，按照5×104濃度接種于無菌細胞培養(yǎng)板中，待細胞的融合度生長至75%～85%，使用0.5%胰蛋白酶消化后，按照Lipofectamine 2000說明書分別將miR-23b-3p模擬物、miR-23b-3p抑制物和miRNA對照(negative control, NC)組轉(zhuǎn)染至細胞中。

2.4RT-qPCR分析miR-23b-3p和XIAP mRNA的表達水平 取轉(zhuǎn)染48 h后的3組細胞常規(guī)培養(yǎng)，當(dāng)細胞覆蓋率80%時，收集細胞，使用TRIzol提取細胞中的RNA，電泳檢測質(zhì)量，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，具體操作參考說明書。實驗以U6和GAPDH為內(nèi)參照，計算公式為2-ΔΔCt，每組3個重復(fù)。U6的上游引物序列為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物引物序列為5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’； miR-23b-3p的上游引物序列為5’-CGCATCACATTGCCAGGG-3’,下游引物序列為5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’。GAPDH上游引物為5’-GAAGGTCGGAGTCAACGG-3’，下游引物5’-GGAAGATGGTGATGGGATT-3’；XIAP上游引物5’-AATTGGGAACCTTGTGATCG-3’,下游引物為5’-AGAAAGTGTCGCCTGTGTT-3’。反應(yīng)體系為20 μL，具體參考說明書。

2.5CCK-8檢測細胞的活力 調(diào)整轉(zhuǎn)染成功的3組細胞濃度為2×108/L，每孔100 μL接種至96孔板中，在37 ℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72和96 h后，避光添加100 μL CCK-8溶液，使用酶標(biāo)儀檢測A450值，繪制細胞活力隨時間變化的曲線，每組3個重復(fù)。

2.6流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 離心收集成功轉(zhuǎn)染miR-23b-3p模擬物、抑制物和對照miRNA的3組細胞，PBS緩沖液重懸細胞后，避光條件下加入含有propidium iodide (PI)和Annexin V-FITC的溶液，孵育20 min，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，每組3個重復(fù)。

2.7Western blot分析 收集成功轉(zhuǎn)染3組細胞，RIPA裂解提取細胞內(nèi)總蛋白，離心收集上清液，BCA法進行蛋白定量。每組細胞取60 μg蛋白做SDS-PAGE，結(jié)束后轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜上。之后，使用BCA低溫封閉過夜，TBST洗膜5次，加入Ⅰ抗搖晃孵育2 h，TBST再次洗膜5次，加入Ⅱ抗搖晃孵育1 h，TBST最后洗膜5次。將膜取出在暗室中進行曝光成像，并對表達量進行分析。

3 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0軟件，計量結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組和多組間比較分別采用t檢驗和單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 miR-23b-3p和XIAP mRNA的表達水平

RT-qPCR結(jié)果顯示，正常滑膜成纖維細胞和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細胞的miR-23b-3p相對表達水平分別為1.00±0.03和0.42±0.05，XIAP mRNA的相對表達水平分別為1.00±0.05和1.56±0.11。與正常關(guān)節(jié)滑膜成纖維細胞相比，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細胞中的miR-23b-3p表達顯著下調(diào)(P<0.05),XIAP的mRNA表達顯著上調(diào)(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.The expression level of miR-23b-3p and XIAP mRNA in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖1 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細胞中miR-23b-3p和XIAP mRNA表達水平

2 XIAP是miR-23b-3p的潛在靶標(biāo)

TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)果顯示,XIAP的3’-UTR中含有與miR-23b-3p種子區(qū)互補序列,見圖2A。雙螢光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，與XIAP-3’-UTR-WT NC組相比，miR-23b-3p模擬物與XIAP-3’-UTR-WT共轉(zhuǎn)染使螢光素酶活性顯著降低(P<0.05)，而miR-23b-3p模擬物與XIAP-3’-UTR-Mut共轉(zhuǎn)染后螢光素酶的活性無顯著變化(P>0.05)，見圖2B。

Figure 2.Verification of targeting relationship between miR-23b-3p and XIAP. A: the targeting relationship between miR-23b-3p and XIAP was predicted by TargetScan; B: dual-luciferase reporter assay was used to confirm the targeting relationship. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs3′-UTR-WT NC group.

圖2 miR-23b-3p與XIAP靶向關(guān)系驗證

3 miR-23b-3p抑制XIAP的表達

與對照組相比，miR-23b-3p模擬物顯著提高miR-23b-3p表達水平，減少XIAP表達水平；miR-23b-3p抑制物則使miR-23b-3p表達下調(diào)，XIAP表達上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

4 miR-23b-3p對細胞活力具有抑制作用

CCK-8法結(jié)果顯示，與對照組相比，miR-23b-3p模擬物對細胞的活力出現(xiàn)了抑制現(xiàn)象，miR-23b-3p抑制劑促進了細胞活力，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

5 miR-23b-3p對細胞凋亡的影響

流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡結(jié)果顯示，與對照組相比，miR-23b-3p抑制物組凋亡率顯著減少，而miR-23b-3p模擬物則促進了細胞的凋亡(P<0.05),見圖5。

Figure 3.The expression of XIAP mRNA and miR-23b-3p detected by RT-qPCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC group.

圖3 miR-23b-3p模擬物和抑制物對miR-23b-3p和XIAP mRNA表達水平的影響

Figure 4.The effect of miR-23b-3p on the cell viability. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC group.

圖4 miR-23b-3p對細胞活力的影響

6 miR-23b-3p對增殖和凋亡相關(guān)蛋白的影響

Western blot檢測miR-23b-3p抑制物組、模擬物和對照組胞內(nèi)增殖相關(guān)蛋白Ki67以及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2表達量，結(jié)果顯示，3組細胞內(nèi)的Ki67蛋白表達量分別為：miR-23b-3p抑制物組1.14±0.20，對照組0.81±0.03，miR-23b-3p模擬物組0.35±0.02；Bcl-2蛋白表達量分別為：miR-23b-3p抑制物組2.27±0.20，對照組1.02±0.04，miR-23b-3p模擬物組0.76±0.04，整體比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(FKi67=34.308，PKi67<0.05；FBcl-2=135.771，PBcl-2<0.05),見圖6。

Figure 5.The effect of miR-23b-3p on apoptosis. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC group.

圖5 miR-23b-3p對細胞凋亡的影響

Figure 6.The protein expression levels of Ki67 and Bcl-2 were detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC group.

圖6 Western blot檢測Ki67和Bcl-2蛋白表達水平

討 論

RA是一種表現(xiàn)為滑膜細胞異常增殖的自身免疫性疾病，其滑膜細胞組織結(jié)構(gòu)可增生至8層以上，遠遠大于正?；そM織的1～2層的細胞層，這種過度異常增殖的滑膜最終將向關(guān)節(jié)處的軟骨組織侵襲性生長，導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形，造成關(guān)節(jié)活動受限[11-12]。其中，在RA中起著重要作用的滑膜細胞即為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細胞，在RA患者滑液中含有多種細胞促炎因子及抗凋亡因子，使滑膜組織細胞的增殖與凋亡速度失衡，從而出現(xiàn)異常增殖的現(xiàn)象[13-15]。在RA出現(xiàn)多種miRNA上調(diào)或下調(diào)，包括顯著上調(diào)的miR-155，其被證實參與了細胞的多種炎癥反應(yīng)，能夠抑制MMP-3來減緩組織炎癥損傷和增強組織中CD14+細胞的抗凋亡能力[6,16-17]；低表達的miR-124a與增殖相關(guān)蛋白CDK2以及MCP-1具有靶向關(guān)系，其下調(diào)表達促進了RA的發(fā)生進程[9]。除此之外，miR-23b是一種具有抗炎作用的保護性miRNA，在RA滑膜成纖維細胞中表達同樣顯著下調(diào)，并且其介導(dǎo)的TGF-β、IκB激酶、TAB2和細胞因子的表達受IL-7炎癥因子的負調(diào)控[10, 18-19]。為探討miR-23b-3p在RA的作用機制，本研究通過RT-qPCR檢測miR-23b-3p在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細胞的表達情況。結(jié)果顯示，miR-23b-3p在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細胞中的表達水平是正常細胞的一半左右，顯著下調(diào)表達，與文獻[10]報道一致。

XIAP是IAP家族中的重要一員，可直接通過與caspase類蛋白作用而抑制其功能，是細胞中一種不可或缺的凋亡抑制因子[20]。多種疾病均伴隨著XIAP的失調(diào)表達，其中XIAP的丟失會增強細胞的敏感性，XIAP上調(diào)表達能增強細胞的抗輻射能力并且可能與腫瘤有著重要聯(lián)系[21-24]。除此之外，有研究表明XIAP能夠依賴自身的抗凋亡能力對細胞的自噬途徑產(chǎn)生重要影響[25]。同時，XIAP在腫瘤中受到多種miRNA的調(diào)控，與細胞的生物學(xué)活動有著重要聯(lián)系[21, 26-28]。在本研究，TargeScan軟件分析顯示，XIAP的3’UTR含有miR-23b-3p種子互補區(qū)的保守序列，是miR-23b-3p的一個潛在靶基因。本研究將miR-23b-3p模擬物與XIAP-3’-UTR-WT共轉(zhuǎn)染細胞后，螢光素酶活性顯著降低，證實了兩者之間的靶向關(guān)系。為進一步探討兩者之間的具體調(diào)控機制，將miR-23b-3p的模擬物和抑制物轉(zhuǎn)染到細胞中，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-23b-3p模擬物和抑制物后，XIAP mRNA分別顯著下調(diào)5倍和上調(diào)表達2倍左右，表明XIAP受miR-23b-3p的負向調(diào)控。此外，本研究表明轉(zhuǎn)染miR-23b-3p能夠抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細胞的增殖并促進其發(fā)生凋亡，轉(zhuǎn)染抑制物的效果與之相反。此時，細胞內(nèi)增殖相關(guān)蛋白Ki67和抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2與miR-23b-3p表達量負相關(guān)，上調(diào)miR-23b-3p促使Ki67和Bcl-2下調(diào)表達，敲低miR-23b-3p則促進促使Ki67和Bcl-2表達上調(diào)。以上結(jié)果表明，miR-23b-3p可通過靶向XIAP抑制細胞增殖促進凋亡在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中發(fā)揮保護作用。本研究雖探討了miR-23b-3p對XIAP的調(diào)控機制，但是文獻中提到的miR-23b-3p的抗炎作用和本研究證實的促凋亡保護機制之間的協(xié)同性仍需進一步研究。

綜上所述，miR-23b與RA有著緊密聯(lián)系，可通過靶向XIAP抑制RA滑膜成纖維細胞增殖，促進其凋亡。