杜 斌， 龔蕾蕾， 蔡維維， 陳俊良， 孫海建， 邱麗穎

(江南大學(xué)無錫醫(yī)學(xué)院， 江蘇 無錫 214122)

人類飲食結(jié)構(gòu)改變及食品安全、農(nóng)藥殘留和水質(zhì)污染等因素使急性肝損傷的發(fā)病率在我國呈逐年上升趨勢。合歡皮(CortexAlbiziae)為豆科植物合歡(AlbiziajulibrissinDurazz.)的干燥樹皮，資源豐富，在我國有悠久的臨床應(yīng)用歷史?！吨袊幍洹芳肮欧接涊d合歡皮具有活血和消癰腫之功[1]。合歡皮提取物能有效抑制腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)對核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)的活化[2]。霍樂樂等[3]利用單味合歡皮煎液熏洗治療屈指肌腱鞘炎42例臨床研究證明可有效緩解屈指肌腱鞘炎引起的疼痛癥狀，從而改善手指關(guān)節(jié)功能，且復(fù)發(fā)率低。合歡皮具有調(diào)節(jié)免疫和炎癥抑制作用，并抑制巨噬細(xì)胞的活化[4]。喬善義等[5]以巴豆油引起小鼠耳腫脹模型作為抗炎篩選模型，發(fā)現(xiàn)合歡皮乙醇提取物的正丁醇萃取部位是抗炎活性的主要部位。而急性肝損傷屬于炎癥反應(yīng)的范疇，合歡皮可能有抗急性肝損傷的藥理作用是本研究的選題依據(jù)。

本實(shí)驗室前期研究已表明合歡皮總皂苷的含量可達(dá)63.49%，合歡皮乙醇提取物正丁醇部位富含皂苷類物質(zhì)，主要集中在AJ-B-4組分。本實(shí)驗室近年研究發(fā)現(xiàn)，合歡皮有效部位具有抑制腫瘤新生血管、抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、抑制人微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、抑制脂質(zhì)合成代謝和抗旋毛蟲感染等作用[6-7]。此外，合歡皮的活性成分較多，富含多種成分，其藥理作用是否有協(xié)同作用？基于對合歡皮的深入研究，本研究進(jìn)一步探討合歡皮乙醇提取物對保護(hù)肝臟作用的靶向性。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗動物

ICR小鼠，雄性，體質(zhì)量20～22 g，購自浙江省實(shí)驗動物中心，許可證號為SCXK(浙)20140001。

2 主要試劑

天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)測試試劑盒購自桂林優(yōu)利特醫(yī)療電子有限公司；白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)、TNF-α、兔抗鼠Bax抗體和兔抗鼠Bcl-2抗體購自武漢博士德生物科技有限公司；兔抗NF-κB p65抗體購自Abcam；兔抗histone H3多克隆抗體和兔抗β-actin多克隆抗體購自Bioworld Technology；其余試劑為國產(chǎn)化學(xué)分析純。

3 主要儀器

URIT-8260全自動生化分析儀(桂林優(yōu)利特醫(yī)療電子有限公司)；ST5020多功能染色機(jī)、RM2245石蠟切片機(jī)和ASP200S全自動脫水機(jī)(Leica)；ELx800全自動酶標(biāo)儀(BioTek)；Universal Hood III凝膠成像分析系統(tǒng)、Mini Protean Tetra垂直電泳儀和Mini Trans Blot Cell轉(zhuǎn)印儀(Bio-Rad)； SHB-ⅢA循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)。

4 主要方法

4.1合歡皮乙醇提取物混懸液的制備 合歡皮購自無錫山禾集團(tuán)中藥飲片有限公司，南京中醫(yī)藥大學(xué)陳健偉教授鑒定為AlbiziajulibrissinDurazz. 的干燥樹皮。稱量合歡皮1 100 g，破碎過60目篩，將其用1∶10料液比的85%乙醇(65 ℃)回流提取3 h，3次，濾后合并濾液，旋蒸至無醇味，真空干燥，得合歡皮總提取物浸膏或干粉。稱其93 g，于2 500 mL梨形漏斗水中，充分溶解。根據(jù)極性提取，收集正丁醇相。分別萃取3次，每次2 h，分別合并萃取液，旋蒸真空干燥，浸膏或干粉，放入-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。取合歡皮正丁醇相萃取物適量，0.9%氯化鈉配制成混懸液。紫外分光光度法測得合歡皮乙醇提取物正丁醇相黃酮的含量為65.2 mg/g。

4.2實(shí)驗分組及給藥 32只雄性小鼠隨機(jī)分為4組，每組8只，分別為正常(control)組、模型(model)組、合歡皮乙醇提取物正丁醇相低劑量(AB-L，4 mg·kg-1·d-1)組和合歡皮乙醇提取物正丁醇相高劑量(AB-H，8 mg·kg-1·d-1)組[8]。Model組四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)和橄欖油根據(jù)體積比混合, 配制成25%CCl4，根據(jù)小鼠體重?fù)Q算藥物劑量，腹腔注射給藥5 mL/kg。Control組給予同體積橄欖油。給藥組造模2 h后給藥，連續(xù)給藥10 d。

4.3生化指標(biāo)的測定 對各組小鼠眼球內(nèi)眥靜脈叢取血，分離血清。根據(jù)試劑盒及全自動生化分析儀使用要求，檢測血清中ALT和AST水平。

4.4HE染色 取小鼠部分肝右葉置于4%多聚甲醛溶液中浸泡固定，脫水透明、浸蠟包埋，切片厚度為4 μm，連續(xù)切片。脫蠟染色、脫水透明封片，在顯微鏡下攝片觀察。

4.5肝組織中總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)活性和丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量的檢測 -80 ℃超低溫冰箱中快速取出凍存的肝臟組織，冰塊上低溫研磨并配制成10%肝組織勻漿液。低溫冷凍離心后吸取上清液適量，按1∶9生理鹽水稀釋成1%肝組織勻漿液，根據(jù)試劑盒說明書檢測。

4.6測定小鼠血清中IL-6和TNF-α的水平 試劑盒自然解凍(冰盒上)；血清樣本2倍稀釋；所需酶標(biāo)板孔數(shù)目=樣品數(shù)+9；做雙份檢測時×2。根據(jù)ELISA試劑盒說明書檢測。

4.7Western blot 檢測各組小鼠肝細(xì)胞中NF-κB p65、Bax和Bcl-2的蛋白表達(dá)水平 取各組小鼠肝左葉組織100 mg左右，剪碎后置于玻璃勻漿器最底部，按每100 mg肝組織，加入PMSF酶抑制劑和RIPA裂解液(1∶100)混合液600 μL，冰上手動勻漿10 min左右。裂解后的組織勻漿移到1.5 mL EP管中，4 ℃、14 000 r/min離心10 min后收集上清，分裝并轉(zhuǎn)移到1.5 mL EP管中。根據(jù)試劑盒說明書檢測。采用ImageJ軟件分析條帶灰度，以NF-κB p65灰度與histone H3 灰度的比值反映NF-κB p65蛋白的表達(dá)水平；以Bax和Bcl-2灰度分別與β-actin 灰度的比值反映Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)水平。

5 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 病理學(xué)觀察

Control組肝細(xì)胞基本形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，肝小葉形態(tài)完整，肝細(xì)胞核仁清晰。Model組肝細(xì)胞呈現(xiàn)腫脹、變形，可見炎癥細(xì)胞部分浸潤。與model組比較，AB-L組和AB-H組的肝細(xì)胞腫脹、變形明顯減輕，見圖1。

Figure 1.The pathological observation of mouse liver in each group (HE staining, ×40).

圖1 各組小鼠肝臟病理形態(tài)學(xué)觀察

2 各組小鼠血清ALT和AST水平的變化

與control組比較，model組血清中ALT和AST水平顯著升高;與model組比較，AB-H組和AB-L組血清的ALT和AST水平顯著降低(P<0.05)，見表1。

3 各組小鼠血清中IL-6和TNFα的影響

與control組比較，model組小鼠血清中TNF-α和IL-6水平明顯升高(P<0.05)，與model組比較，AB-H組和AB-L組小鼠血清中TNF-α和IL-6水平均明顯降低(P<0.05)，提示合歡皮可能通過抑制炎癥而發(fā)揮保護(hù)肝臟的作用，見表1。

4 各組小鼠肝組織中SOD活性和MDA水平的影響

與control組比較，model組小鼠SOD活性明顯降低(P<0.05)，MDA 含量明顯升高(P<0.05)；與model組比較，AB-H組和AB-L組的肝組織中SOD 的活性均明顯升高(P<0.05)，MDA 的含量明顯降低(P<0.05)。AB-H組和AB-L組的SOD活性和MDA含量呈劑量依賴性(P<0.05)，見表2。上述實(shí)驗結(jié)果表明，合歡皮乙醇提取物正丁醇相可能通過抑制肝細(xì)胞脂質(zhì)過氧化從而發(fā)揮保肝降酶作用。

表1 各組小鼠AST、 ALT和IL-6、TNF-α的變化

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group;△P<0.05vsAB-L group.

表2 各組小鼠肝組織中SOD活性和MDA 水平的影響

Table 2.The activity of SOD and content of MDA of mouse liver tissues in each group (Mean±SD.n=8)

GroupSOD(U/mg)MDA (μmol/g)Control 38.80±2.695.09±0.29Model 13.86±1.62?14.66±0.69?AB-L 19.83±2.15?#10.84±0.46?#AB-H 26.50±3.71?#△7.16±0.21?#△

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group;△P<0.05vsAB-L group.

5 Western blot 檢測各組小鼠肝細(xì)胞核中NF-κB p65的蛋白表達(dá)水平

各組小鼠肝細(xì)胞核中NF-κB p65蛋白表達(dá)水平實(shí)驗結(jié)果顯示，與control 組比較，model組中NF-κB p65的蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，而AB-H組和AB-L組的小鼠肝細(xì)胞核中NF-κB p65的蛋白表達(dá)水平較model組顯著降低(P<0.05)，見圖2。

Figure 2.The protein expression of NF-κB p65 in the nuclei of the mouse hepatocytes in each group. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group;△P<0.05vsAB-L group.

圖2 各組小鼠肝細(xì)胞核中NF-κB p65蛋白表達(dá)水平

6 Western blot 檢測各組小鼠肝細(xì)胞Bax和Bcl-2的蛋白表達(dá)水平

與control 組比較，model組肝臟組織中Bax蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)，Bcl-2/Bax比值降低(P<0.05)。與model 組比較，AB-H組和AB-L組的肝組織中Bax蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)，Bcl-2/Bax比值升高(P<0.05)，見圖3。

Figure 3.The protein expression of Bax and Bcl-2 in the liver tissues of the mice in each group. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group;△P<0.05vsAB-L group

圖3 各組小鼠肝組織中Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)水平

討 論

急性肝損傷的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，大致可分為免疫性損傷和化學(xué)性損傷。不同的致病因素或病因引起急性肝損傷的發(fā)病機(jī)制也不盡相同。急性肝損傷的發(fā)生機(jī)制可能有單一因素或多個因素組成，它們之間相互聯(lián)系、相互影響或互為因果等。急性肝損傷時使肝細(xì)胞膜的通透性增加，肝細(xì)胞內(nèi)的AST和ALT溢出，從而導(dǎo)致血清中AST和ALT升高，其活性可作為評價肝損傷程度的指標(biāo)[9-10]。MDA 的高低可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接地反映出機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。SOD對機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，具有清除自由基、防止自由基發(fā)生脂質(zhì)過氧化的作用，其活力的高低可間接地反映機(jī)體清除氧自由基的能力[11]。本研究中，AB-H組和AB-L組可明顯降低小鼠血清中AST和ALT水平。AB-H組和AB-L組提高肝組織中SOD 的活性，降低了MDA 含量。通過HE染色的病理學(xué)觀察，肝細(xì)胞炎細(xì)胞浸潤和變性壞死的程度都較model 組有明顯減輕，初步說明合歡皮乙醇提取物正丁醇相可以降低CCl4誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷，其作用機(jī)制可能與促進(jìn)肝細(xì)胞細(xì)胞對抗氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。

TNF-α是同時具有促炎和免疫調(diào)節(jié)雙重功能的細(xì)胞因子，肝臟是TNF-α的重要靶器官之一。IL-6作為炎癥反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)介質(zhì)，在炎癥反應(yīng)中起到關(guān)鍵的作用。TNF-α在病理狀態(tài)下能誘導(dǎo)IL-6等炎癥因子的產(chǎn)生。NF-κB已經(jīng)被證實(shí)是具有多種功能的轉(zhuǎn)錄因子，p65是涉及NF-κB激活的一個重要亞基[12]。NF-κB介導(dǎo)的Bcl-2 家族蛋白被認(rèn)為是線粒體凋亡途徑中的主要調(diào)控蛋白[13]。線粒體膜上承載著Bcl-2家族，并能監(jiān)管肝細(xì)胞凋亡的過程[14]。抗凋亡蛋白Bcl-2與促凋亡蛋白Bax之間的比值大小直接關(guān)系著機(jī)體細(xì)胞凋亡的變化，其比值升高提示抑制肝細(xì)胞凋亡發(fā)展，反之則提示促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡發(fā)展。本研究中，與model 組比較AB-H組和AB-L組小鼠血清中TNF-α和IL-6水平明顯下降，提示合歡皮正丁醇相可能通過抑制炎癥細(xì)胞因子TNF-α和IL-6而發(fā)揮保護(hù)肝臟的作用。Western blot 檢測各組小鼠肝細(xì)胞核中NF-κB p65的蛋白表達(dá)水平，AB-H組和AB-L組的小鼠肝細(xì)胞核中NF-κB p65的蛋白表達(dá)水平較model組顯著降低，提示合歡皮乙醇提取物正丁醇相可能通過減少NF-κB的活化，抑制IL-6和TNF-α炎癥細(xì)胞因子的進(jìn)一步釋放而發(fā)揮保肝降酶的作用。與model 組比較，AB-H組和AB-L組抑制促凋亡Bax蛋白表達(dá)和增加抗凋亡Bcl-2蛋白表達(dá)，Bcl-2/Bax比值升高，表明肝細(xì)胞凋亡減少。肝細(xì)胞凋亡的發(fā)生可能與氧化應(yīng)激和促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡的TNF-α有關(guān)[15]。實(shí)驗結(jié)果表明合歡皮乙醇提取物正丁醇相可能通過調(diào)控Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)減輕肝細(xì)胞的凋亡，從而發(fā)揮對肝臟的保護(hù)作用。

綜上所述，合歡皮乙醇提取物正丁醇相可減輕小鼠急性肝損傷，AB-H組和AB-L組呈現(xiàn)量效關(guān)系。合歡皮乙醇提取物正丁醇相可能通過減少NF-κB p65的活化而抑制IL-6和TNF-α炎性細(xì)胞因子的過度釋放，以及調(diào)控Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)減輕肝細(xì)胞的凋亡，從而發(fā)揮對肝臟的保護(hù)作用。