袁杰彬，孫 琳，李 茂

（宜賓五糧液股份有限公司技術(shù)研究中心，四川宜賓644000）

紫薯是一種富含花青素的薯類新品種，除含有普通甘薯所具有的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以外，還富含紫薯花青素（PSPAs），已有研究證實(shí)紫薯花青素具有消炎[1]、抗氧化生物活性[2]、抗突變[3]、對(duì)肝損傷提供保護(hù)[4]、抗動(dòng)脈粥樣硬化[5]等益處。以紫薯為原料，參照果酒釀造工藝開發(fā)的紫薯酒飲料新品，具有良好的色澤和薯香，有別于傳統(tǒng)的調(diào)配酒飲料，不僅保留了絕大部分紫薯營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還保留了紫薯中的花青素。發(fā)酵是紫薯酒生產(chǎn)過程中的重要環(huán)節(jié)，直接影響后期成品酒的品質(zhì)，本研究采用Box-Behnken響應(yīng)面法對(duì)紫薯酒發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，找出最佳發(fā)酵條件，同時(shí)對(duì)紫薯酒的香氣成分進(jìn)行研究，采用頂空固相微萃取法提取富集紫薯酒的香氣成分物質(zhì)，再運(yùn)用GC-MS聯(lián)用法對(duì)紫薯酒中香氣組分進(jìn)行測(cè)定和分析，盡可能詳細(xì)表達(dá)出紫薯酒的香味特征。為進(jìn)一步提高紫薯酒品質(zhì)做好基礎(chǔ)研究，促進(jìn)紫薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料

紫薯：產(chǎn)地四川宜賓。

試劑及耗材：檸檬酸、碳酸鈣，國產(chǎn)分析純；α-淀粉酶、糖化酶，無錫賽德生物工程有限公司；安琪高活性釀酒干酵母；矢車菊素標(biāo)品，純度＞98%，成都曼思特生物科技有限公司；高速冷凍離心機(jī)，德國eppendorf；安捷倫7890氣相色譜儀質(zhì)譜儀聯(lián)用；紫外可見分光光度計(jì)，國產(chǎn)754型；酒精計(jì)、糖度計(jì)，成都科普達(dá)科技有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紫薯汁制備

紫薯蒸煮熟透，去皮切塊后按照料液比為1∶2加水（含0.01%檸檬酸）打漿，經(jīng)α-淀粉酶液化，糖化酶糖化后過濾取汁，冷藏備用。

1.2.2 發(fā)酵條件

1.2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

溫度對(duì)紫薯酒發(fā)酵影響：調(diào)整發(fā)酵液起始糖度為20 °Bx，pH4.0，接菌量為3.0‰，分別于16 ℃、20℃、24℃、26℃、28℃、32℃發(fā)酵7 d，測(cè)定酒精度及花青素含量。

pH值對(duì)紫薯酒發(fā)酵影響：初始糖度調(diào)整為20°Bx，分別調(diào)發(fā)酵液pH3.5、pH4、pH4.5、pH5、pH5.5，接菌量均為3.0‰，于26℃發(fā)酵7 d，測(cè)定酒精度及花青素含量。

初始糖度對(duì)紫薯酒發(fā)酵影響：發(fā)酵液pH4.0，分別調(diào)整糖度為16 °Bx、18 °Bx、20 °Bx、22 °Bx、24 °Bx、26°Bx，接菌量均為1.5‰，于26℃發(fā)酵7 d，測(cè)定酒精度及花青素含量。

接菌量對(duì)紫薯酒發(fā)酵影響：發(fā)酵液初始糖度均調(diào)整為20°Bx，pH4.0，調(diào)整接菌量依次為0.5‰、1‰、1.5‰、2‰、2.5‰，26℃發(fā)酵7 d，測(cè)定酒精度及花青素含量。

1.2.2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用4因素3水平的Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)方法進(jìn)行試驗(yàn)，見表1，以酒精含量和花青素含量為響應(yīng)值，優(yōu)化發(fā)酵條件。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平編碼表

1.2.3 紫薯酒香氣成分測(cè)定

取8 mL紫薯酒于20 mL萃取瓶中，加入1.0 g氯化鈉，48℃吸附平衡30 min。吸附結(jié)束后將吸附有目標(biāo)物質(zhì)的萃取頭插入進(jìn)樣口，解析6 min。用相同方法處理其余待測(cè)酒樣。

色譜分析條件：選擇不分流模式，程序升溫：35℃保持5 min，以10℃/min升至100℃，保持3 min，以15℃/min升至230℃，保持5 min。載氣為高純度氦氣，流量為1 mL/min，進(jìn)樣口溫度和檢測(cè)器及各接口溫度均設(shè)定為250℃。

質(zhì)譜分析條件：電力方式為EI,電壓70 eV，離子源溫度230℃，四級(jí)桿溫度150℃，掃描范圍30～800 u。

1.2.4 指標(biāo)測(cè)定

1.2.4.1 酒精度

參照GB/T 15038—2006測(cè)定。

1.2.4.2 花青素含量[7]

將紫薯酒于12000 r/min離心5 min，取上清液，以水為空白，將稀釋后的酒液于530 nm處測(cè)定吸光度，3次測(cè)定值求平均值。原酒中花青素含量的（μg/mL）計(jì)算公式：

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 溫度對(duì)紫薯酒發(fā)酵影響

溫度對(duì)紫薯酒發(fā)酵的影響如圖1所示，隨著發(fā)酵溫度的逐步升高，紫薯酒中花青素含量在一定溫度范圍內(nèi)較為穩(wěn)定，超過24℃，花青素含量呈下降趨勢(shì)；酒精含量隨著溫度的升高而逐漸增加，當(dāng)溫度達(dá)到22℃時(shí)酒精含量最高，進(jìn)一步升高溫度，加快了酵母生長(zhǎng)老化速度，酒精度及花青素含量均降低。綜合考慮兩種評(píng)價(jià)指標(biāo)選擇發(fā)酵溫度，確定20℃、22℃、24℃為紫薯酒的響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)溫度因素水平，以確定最佳發(fā)酵溫度。

圖1 溫度對(duì)紫薯酒發(fā)酵的影響

2.1.2 pH值對(duì)紫薯酒發(fā)酵影響

pH值對(duì)紫薯酒發(fā)酵的影響見圖2。由圖2可知，隨著發(fā)酵起始pH值逐步提高，花青素含量逐漸降低，酒精度在pH3.5～4.5區(qū)間有一明顯頂點(diǎn)值，最大酒精含量為12.8%vol，之后酒精度逐漸下降。綜合考慮兩種評(píng)價(jià)指標(biāo)選取發(fā)酵液初始pH最佳值，確定初始pH3.5、pH4、pH4.5為紫薯酒的響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)因素水平，以確定最佳初始pH值。

圖2 pH值對(duì)紫薯酒發(fā)酵的影響

2.1.3 初始糖度對(duì)紫薯酒發(fā)酵影響

初始糖度對(duì)紫薯酒發(fā)酵的影響結(jié)果如圖3所示，隨著糖度的逐步提高，酒精度也隨之呈上升趨勢(shì)；糖度在16～22°Bx之間，花青素含量趨于穩(wěn)定，含量變化不明顯，但當(dāng)糖度大于22°Bx后，花青素含量明顯降低。綜合考慮兩種指標(biāo)，選取初始糖度20 °Bx、21 °Bx、22 °Bx作為紫薯酒發(fā)酵條件響應(yīng)面分析對(duì)應(yīng)因素水平，以確定最佳發(fā)酵條件。

圖3 初始糖度對(duì)紫薯酒發(fā)酵的影響

2.1.4 接種量對(duì)紫薯酒發(fā)酵影響

酵母接種量對(duì)紫薯酒發(fā)酵的影響如圖4，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，接種量介于0.25‰～1‰之間時(shí)存在頂點(diǎn)值，當(dāng)接種量為0.5‰時(shí)，酒精度與花青素含量均達(dá)到最大，之后逐步下降，隨著接種量逐步增大，花青素含量基本趨于穩(wěn)定，但酒精度下降趨勢(shì)較為明顯。綜合考慮兩種指標(biāo)，選取接種量0.3‰、0.5‰、0.7‰作為紫薯酒發(fā)酵條件響應(yīng)面分析對(duì)應(yīng)因素水平，以確定最佳發(fā)酵條件。

圖4 接種量對(duì)紫薯酒發(fā)酵的影響

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵條件

2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果

利用Design-Expert 8.0.6軟件中BBD方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，共需安排27組試驗(yàn)，并分別以各組原酒的酒精度和花青素含量作為雙響應(yīng)值。結(jié)果如表2。

2.2.2 回歸模型的建立及分析

2.2.2.1 模型建立

根據(jù)表3中實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸方程擬合，并分別以酒精度（R1）和花青素含量（R2）為響應(yīng)結(jié)果建立數(shù)學(xué)回歸模型：

表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.2.2.2 回歸分析

由表3可知，模型的P=0.0006＜0.01，說明所構(gòu)建的模型方程（Ⅰ）為極顯著；模型失擬項(xiàng)表示模型預(yù)測(cè)值與實(shí)際值不擬合的概率，由模型Ⅰ失擬項(xiàng)p=0.5909＞0.05為極不顯著；模型決定系數(shù)R2=0.8971，校正決定系數(shù)R2（Adj）=0.8771，說明該模型與實(shí)際擬合度較高，響應(yīng)值的87.7%是由于所選變量引起；模型的離散系數(shù)CV值反映了實(shí)驗(yàn)的精度水平，該值越小，精度越高。當(dāng)花青素含量為響應(yīng)時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果C.V=2.67%，表明試驗(yàn)操作可信度較好。證明所構(gòu)建回歸方程模型能很好地預(yù)測(cè)和分析對(duì)應(yīng)的紫薯酒原酒酒精度。

模型回歸方程系數(shù)顯著性分析結(jié)果見表4，可知模型方程（Ⅰ）中除一次項(xiàng)B、D和二次交互項(xiàng)AD、BC為不顯著外，其余各項(xiàng)均對(duì)酒精度的影響達(dá)顯著水平。其中二次交互項(xiàng)BD，各二次項(xiàng)均為極顯著，一次項(xiàng)A、C，交互項(xiàng)AB、AC、CD均為顯著水平。通過比較各一次項(xiàng)系數(shù)絕對(duì)值，可知各因素對(duì)紫薯酒酒精度含量影響的強(qiáng)弱關(guān)系：初始糖度＞溫度＞初始pH值＞接種量。

由表4可知，模型的P=0.0003＜0.01，說明所構(gòu)建的模型方程（Ⅱ）為極顯著；模型失擬項(xiàng)表示模型預(yù)測(cè)值與實(shí)際值不擬合的概率，由模型失擬項(xiàng)p=0.8435＞0.05可知不顯著；模型決定系數(shù)R2=0.9082，校正決定系數(shù)R2（Adj）=0.851，說明模型與實(shí)際擬合度較高，響應(yīng)值的85.1%是由于所選變量引起；模型的離散系數(shù)CV值反映了實(shí)驗(yàn)的精度水平，該值越小，精度越高。當(dāng)花青素含量為響應(yīng)時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果C.V=7.79%，在可接受范圍內(nèi)，試驗(yàn)操作可信度較好。證明所構(gòu)建回歸方程模型能很好地預(yù)測(cè)和分析對(duì)應(yīng)的紫薯原酒中花青素含量。

表3 方差分析結(jié)果(R值為酒精度)

表4 方差分析結(jié)果(R值為花青素含量)

對(duì)模型回歸方程系數(shù)顯著性分析結(jié)果見表4，可知模型方程（Ⅱ）中除一次項(xiàng)B和二次交互項(xiàng)AB、BC、BD、CD為不顯著外，其余各項(xiàng)均對(duì)花青素含量的影響達(dá)顯著水平。其中一次項(xiàng)A、C，交互項(xiàng)AC及二次項(xiàng)A、B、C、D均為極顯著；一次項(xiàng)D、交互項(xiàng)AD均為顯著水平。通過比較各一次項(xiàng)系數(shù)的絕對(duì)值，可知各因素對(duì)紫薯酒中花青素含量影響的強(qiáng)弱關(guān)系：溫度＞初始糖度＞接種量＞初始pH值，其中溫度對(duì)花青素的穩(wěn)定性、初始糖度、接種量均影響顯著，考慮到花青素在酸性環(huán)境中較穩(wěn)定[11]，在本實(shí)驗(yàn)中pH值范圍均為酸性，因此實(shí)驗(yàn)中pH值變化對(duì)花青素穩(wěn)定性影響表現(xiàn)出不顯著。

2.2.3 交互作用分析

通過對(duì)表3、表4方差分析結(jié)果，對(duì)各因素間的交互作用對(duì)紫薯酒發(fā)酵的影響顯著的交互項(xiàng)進(jìn)行響應(yīng)面及等高線圖分析。結(jié)果見圖5—圖10。

圖5 初始pH值與溫度對(duì)酒精度的影響

圖6 初始糖度與溫度對(duì)酒精度的影響

圖7 接種量與初始糖度對(duì)酒精度的影響

圖8 接種量與初始pH值對(duì)酒精度的影響

圖9 接種量與溫度對(duì)花青素含量的影響

圖10 初始糖度與溫度對(duì)花青素含量的影響

2.2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

通過軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳紫薯酒發(fā)酵工藝參數(shù)為：溫度21.47℃，初始pH3.89，初始糖度20.63°Bx，酵母接種量0.55‰，所得紫薯酒原液中所含花青素含量為19.86 μg/mL，酒精度為13.46%vol。為對(duì)響應(yīng)面優(yōu)化法所得的實(shí)驗(yàn)條件數(shù)據(jù)進(jìn)行可行性檢驗(yàn)。根據(jù)實(shí)際條件進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，選取試驗(yàn)參數(shù)為溫度21.5℃，初始pH4.0，初始糖度21°Bx，酵母接種量0.55‰。選取3次平行實(shí)驗(yàn)，最終得到紫薯酒原酒花青素含量為19.52 μg/mL，酒精度為13.2%vol。與預(yù)測(cè)值對(duì)應(yīng)誤差分別為1.71%、1.93%。驗(yàn)證了所建模型能較準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，再次證明基于響應(yīng)面優(yōu)化紫薯酒發(fā)酵模型的可靠性。

2.3 紫薯酒香氣成分分析[12-17]

如圖11所示，通過GC-MS對(duì)紫薯酒中所含揮發(fā)性香氣檢測(cè)，利用NIST圖譜庫進(jìn)行檢索，紫薯酒中共檢測(cè)到約40種揮發(fā)性香氣成分（表5），約占95%檢測(cè)圖譜中總峰面積，根據(jù)結(jié)構(gòu)性質(zhì)不同可以分為醇類、醛類、醚類、酚類、酯類、酮類及烷烴類物質(zhì)。其中醇類包括丙醇、丁醇、異戊醇、異丁醇、正己醇、順-3-己烯醇、3-甲氧基苯甲醇、芳樟醇、α-松油醇、4-萜烯醇、萜品醇、苯乙醇；酯類包括乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁二酸二乙酯、丁酸乙酯、正己酸乙酯、辛酸乙酯、琥珀酸二乙酯、乙酸苯乙酯、乙酸異戊酯、亞油酸乙酯、十八碳-6,9-二烯酸乙酯；酚類物質(zhì)包括4-甲基愈創(chuàng)木酚、2,6-二叔丁基對(duì)甲酚、對(duì)乙基苯酚、2,4-二叔丁基苯酚；酮類物質(zhì)包括3-羥基-2-丁酮、2-吡咯烷酮、吡喃-4-酮、α-吡喃酮、紫羅蘭酮；醚類物質(zhì)有乙基叔丁基醚、仲丁基醚、乙基丁基醚。其中含量較高的物質(zhì)有乙酸乙酯、異戊醇、乳酸乙酯、琥珀酸二乙酯、萜品醇、苯乙醇。

圖11 紫薯酒香氣成分GC-MS分析總離子流色譜圖

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)利用響應(yīng)面法優(yōu)化紫薯酒的發(fā)酵工藝參數(shù)，經(jīng)驗(yàn)證優(yōu)化后的工藝參數(shù)為：溫度21.5℃，初始pH4.0，初始糖度21°Bx，酵母接種量0.55‰。此條件下所得紫薯發(fā)酵原酒酒精度數(shù)和花青素含量分別為13.2%vol和199.52 μg/mL。紫薯酒的香氣是由許多呈香呈味物質(zhì)組分間共同作用構(gòu)成，香氣成分作為紫薯酒重要品質(zhì)指標(biāo)，其揮發(fā)性物質(zhì)種類與含量直接體現(xiàn)出酒體的品質(zhì)特征，為后期進(jìn)一步提升紫薯酒品質(zhì)提供重要參考。

表5 紫薯酒主要香味物質(zhì)