蘇 娟 吉曉濱 李 鵬 李 雯 謝景華

1 廣州市第一人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(廣州 510180) 2 廣州市第一人民醫(yī)院病理科(廣州 510180)

喉鱗狀細(xì)胞癌(1 aryngal squamous cell carcinoma，LSCC)是頭頸部腫瘤比較常見的一種惡性腫瘤，LSCC的發(fā)病率、死亡率一直逐年增加，嚴(yán)重影響人類的生存質(zhì)量。癌有血管依賴性，癌組織中豐富的新生血管為腫瘤的生長提供充足的營養(yǎng)成分、氧氣及癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移途徑[1]。腫瘤微血管密度(microvessel density，MVD)是目前公認(rèn)的評估腫瘤血管生成形態(tài)學(xué)的金標(biāo)準(zhǔn)[2]。血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子31(platelet endothelial cell adhesion molecule-31，CD31)是廣泛應(yīng)用的新生血管生成標(biāo)記物，其標(biāo)記的微血管密度(CD31-MVD)可用于評估腫瘤血管新生，與腫瘤形成、發(fā)展、預(yù)后密切相關(guān)[3]。

果蠅zeste基因增強子同源物2(enhancer of zeste homolog 2，EZH2)屬于多梳基因蛋白，可促進腫瘤血管生成，在多種腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)[4- 6]，是目前腫瘤生物治療研究的新熱點。但迄今關(guān)于EZH2在LSCC中表達(dá)的研究并不多見，EZH2、CD31與LSCC臨床及預(yù)后的關(guān)系研究也很少，我們對此作了測定和探討。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2012年1月—2013年8月就診于廣州市第一人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，并住院行部分喉或全喉切除術(shù)的61例LSCC患者的石蠟組織標(biāo)本。臨床資料齊全，病理明確為LSCC，分化程度明確。術(shù)前均未經(jīng)化療、放療或其他治療。其中男56例，女5例，年齡35～79(60.9±10.8)歲。所有患者均接受術(shù)后常規(guī)隨訪，主要通過電話、門診復(fù)查等形式，隨訪時間≥5年，自確診之日開始，最晚至2018年10月結(jié)束。同期正常對照組20例，其中男18例，女3例，年齡在39～75(58.1±8.9)歲。標(biāo)本來源于接受全喉手術(shù)的患者，標(biāo)本距腫瘤邊緣≥2 cm，病理證實無癌組織。標(biāo)本由兩位病理醫(yī)生雙盲法復(fù)查。

1.2 試劑

CD31單克隆抗體、通用型SP免疫組化檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒購自美國SantaCruz生物工程有限公司；兔抗人EZH2單克隆抗體購自美國Cell Signaling 公司，二抗購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 實驗方法

標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋切片，厚度約4 μm。脫蠟、水化后以3%H2O2室溫孵育10min，消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，熱修復(fù)抗原5min。滴加一抗(EZH2為1:50；CD31為1:100)4 ℃孵育過夜。次日加入二抗37 ℃孵育2 h，DAB室溫下顯色。蘇木精復(fù)染、脫水、透明、中性樹膠封片。用試劑公司提供的大腸癌組織切片作CD31染色的陽性對照，EZH2以已知陽性乳腺癌組織切片做陽性對照。以PBS緩沖液代替一抗做陰性對照。

1.4 結(jié)果判定

CD31-MVD計數(shù)：凡被抗體染成棕黃色的內(nèi)皮細(xì)胞、細(xì)胞簇作為1個微血管計數(shù)，按Weidner[7]法進行，隨機計數(shù)5個高倍鏡下微血管數(shù)，取平均值作為MVD值。EZH2陽性呈棕黃色染色，主要位于細(xì)胞核/胞漿。根據(jù)染色強度和細(xì)胞數(shù)目進行分級。隨機選取5個高倍鏡(×400)下視野取平均值。染色強度：無著色、淡黃色、黃或深黃色、褐或棕褐色分別評為0、1、2、3分；細(xì)胞數(shù)目：無陽性細(xì)胞、陽性細(xì)胞<25%、26%～50%、51%～75%、>75%分別評為：0、1、2、3、4分。兩評分相加：0分為(-)；1～2分為(+)；3～4 分為(++)；5～6分為(+++)，≥3分則為強陽性表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料采用χ2檢驗、Fisher精確檢驗。計量資料采用t檢驗、秩和檢驗，多組間比較用單因素方差分析。相關(guān)性檢驗采用Spearman秩相關(guān)分析。Kaplan-Meier生存分析、Log-rank檢驗和Cox比例風(fēng)險分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CD31的表達(dá)

2.1.1 CD31在LSCC和NLT中的表達(dá)對比 CD31的陽性表達(dá)為棕黃色顆粒，主要集中在腫瘤組織邊緣區(qū)的血管內(nèi)皮細(xì)胞,微血管或呈條索狀、或具有管腔，形態(tài)不規(guī)則，分布不均。而在NLT中微血管形態(tài)規(guī)則，分布少、較均勻(圖1)。61例LSCC中CD31-MVD值(/0.5 mm2)為10.26±2.46，20例NLT中為1.20±1.10，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-15.85，P<0.05)。

A CD31在T3期LSCC中的陽性表達(dá)；B CD31在T4期LSCC中的陽性表達(dá)；C CD31在NLT中的陰性表達(dá)；D CD31在NLT中的弱陽性表達(dá)圖1 CD31在LSCC和NLT中的表達(dá)(SP×400)

2.1.2 CD31-MVD與LSCC臨床病理參數(shù)的關(guān)系 CD31-MVD與LSCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、T分級和臨床分期有關(guān)(P均<0.05，見表1)。

表1 LSCC中CD31-MVD、EZH2表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

*為連續(xù)性校正檢驗結(jié)果

續(xù)表

臨床病理因素nCD31-MVD(/0.5mm2)MVD(x±s)t/FPEZH2-+陽性率/%χ2P組織學(xué)分級 高分化339.55±2.090.8210.4462760.705.500.04 中分化229.86±1.9612165.20 低分化610.67±1.751572.89淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 N0349.32±2.46-3.770.0072759.395.130.04? N+2711.56±2.0812673.38T分級 T178.71±1.804.110.103431.759.200.03 T2139.15±2.1921166.15 T31410.71±2.2321266.71 T42711.19±2.2022571.15臨床分期 Ⅰ78.71±1.804.320.013442.239.600.02 Ⅱ129.17±2.2921065.52 Ⅲ1310.31±1.9721166.15 Ⅳ2911.28±2.2522771.39吸煙指數(shù)(每天吸煙支數(shù)×吸煙年限) <400289.79±2.36-1.450.1552362.970.380.53? ≥4003310.64±2.2242968.22

*為連續(xù)性校正檢驗結(jié)果

2.1.3 CD31-MVD對LSCC的術(shù)后預(yù)后評估 27例術(shù)后5年復(fù)發(fā)患者組的CD31-MVD(/0.5 mm2)為10.19±2.11，高于34例術(shù)后5年未復(fù)發(fā)患者組(8.71±1.43，t=3.26，P<0.05)。

2.2 EZH2的表達(dá)

2.2.1 EZH2在LSCC和NLT中的表達(dá)對比 EZH2蛋白定位于細(xì)胞核，陽性染色深淺不一，表現(xiàn)為棕黃色或棕褐色顆粒狀，可呈灶狀或彌漫分布。LSCC中的染色深，以強陽性為主，NLT中陽性著色淺，以弱陽性為主(圖2)。EZH2蛋白表達(dá)的陽性率在LSCC為65.57%(40/61)，大于NLT 30.0%(6/20)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=23.92，P<0.05)。

A EZH2在LSCC中呈中度陽性表達(dá)；B EZH2在LSCC中呈強陽性表達(dá)；C EZH2在NLT中呈陰性表達(dá)；D EZH2在NLT中呈弱陽性表達(dá)圖2 EZH2在LSCC和NLT中的表達(dá)(SP×400)

2.2.2 EZH2與LSCC臨床病理參數(shù)的關(guān)系 EZH2陽性表達(dá)與組織學(xué)分級、T分級、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05，表1)。

2.2.3 EZH2對LSCC的術(shù)后預(yù)后評估 27例術(shù)后5年復(fù)發(fā)患者組的EZH2陽性率為74.07%(20/27)，高于34例術(shù)后5年未復(fù)發(fā)患者組的EZH2的陽性率(52.94%，18/34，χ2=3.89，P<0.05)。

2.3 CD31-MVD與EZH2的相關(guān)性分析

LSCC中EZH2表達(dá)陽性者的MVD值(/0.5 mm2)為10.62±2.03、陰性者為7.37±2.55，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.53，P<0.05)。CD31-MVD和EZH2呈正相關(guān)(r=0.67，P<0.05，圖3)。

圖3 EZH2與CD31-MVD相關(guān)性分析

2.4 CD31-MVD、EZH2與生存的關(guān)系

2.4.1 生存情況 61例LSCC失訪3例，隨訪率95.08%。3年生存率83.71%，5年生存率70.49%。

2.4.2 生存分析顯示，CD31-MVD逐漸增大，則LSCC總生存率隨之下降。在CD31-MVD各組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=5.03，P<0.05)。61例LSCC患者中，18例≤5年生存組中CD31-MVD值(/0.5 mm2)為10.91±2.13，43例>5年生存組為8.76±2.52，表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.36，P<0.05)。

2.4.3 生存分析顯示，EZH2染色級別增高，則LSCC總生存率隨之下降，在EZH2表達(dá)(-)-(+++)之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.69，P<0.05)。61例LSCC患者中，18例≤5年生存組中與43例>5年生存組相比較，EZH2表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.60，P<0.05)。

2.5 LSCC預(yù)后的單因素分析

組織學(xué)分級、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、吸煙指數(shù)、有無復(fù)發(fā)對預(yù)后的影響有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05，表2)。

2.6 多因素Cox比例風(fēng)險分析

以隨訪5年生存狀態(tài)為結(jié)局變量，1=死亡，0=截尾(生存或失訪)，以表2中有統(tǒng)計意義的因素加上CD31-MVD、EZH2建立回歸模型。在Cox Regression中，CD31-MVD、EZH2、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、有無復(fù)發(fā)是預(yù)后獨立影響因素(見表3)。

2.7 生存模型和預(yù)后指數(shù)

根據(jù)表3結(jié)果，建立LSCC患者的生存模型如下：h(t，x)=h0(t)exp(1.302 X1+1.531 X2+1.509 X3+2.891 X4+2.678 X5)，預(yù)后指數(shù)PI=1.302 X1+1.531 X2+1.509 X3+2.891 X4+2.678 X5(X1：EZH2；X2：CD31-MVD；X3：是否復(fù)發(fā)；X4：臨床分期；X5：有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)。說明：PI值大，則生存的可能性低、預(yù)后差；PI值小則相反。

表2 LSCC患者預(yù)后影響因素的單因素分析結(jié)果 [例(%)]

表3 LSCC患者的Cox比例風(fēng)險模型多因素分析結(jié)果

3 討 論

喉鱗狀細(xì)胞癌作為一種常見的頭頸部腫瘤，其病因一直不明確，目前大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，惡性腫瘤血管生成促進其增殖、浸潤、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。MVD是反映血管生成的重要指標(biāo)，對衡量腫瘤血管生成及預(yù)后具有重要意義[8]。CD31是免疫球蛋白超家族成員，作為血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物，CD31在成熟與未成熟的腫瘤血管中均有表達(dá)，并調(diào)節(jié)腫瘤血管生成。目前臨床上廣泛應(yīng)用CD31對血管內(nèi)皮細(xì)胞進行標(biāo)記，可精確地反映MVD[9]。我們的研究表明：①CD31-MVD值在LSCC組織中的表達(dá)(10.26±2.46)明顯高于NLT(1.20±1.10)。CD31在LSCC中表達(dá)明顯，主要集中于腫瘤組織邊緣區(qū)的血管內(nèi)皮細(xì)胞，而在NLT中表達(dá)較弱，說明CD31可提示惡性腫瘤中新生微血管的旺盛程度；②CD31-MVD值與LSCC的T分級、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、是否復(fù)發(fā)有關(guān)；③生存分析顯示CD31可用于預(yù)后的判斷，CD31-MVD值越大，則生存期越短。

血管生成基因?qū)τ谘芯磕[瘤血管生成機制、探尋生物治療靶點意義非常。EZH2是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種血管生成基因，是多梳基因家族(polycomb group genes， PcGs)的核心成員。腫瘤血管生成機制主要在于血管生成促進因子(如血管內(nèi)皮生成因子、纖維母細(xì)胞生長因子)和血管生成抑制因子(如血管抑素、內(nèi)皮抑素)之間的相互調(diào)節(jié)，血管內(nèi)皮細(xì)胞為調(diào)節(jié)因子作用的靶細(xì)胞，血管生成促進因子濃度升高或抑制因子濃度下降都可促進腫瘤血管生成，造成腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移[10]。而 EZH2主要通過 VEGF-E2、F-EZH2-VASH1[11]和 FGF-2-NDY1/EZH2-miR-101-EZH2[12]機制參與了這一調(diào)節(jié)過程。

許多研究證實，相對于正常組織，EZH2高表達(dá)于多種癌組織，如前列腺癌[13]、乳腺癌[14]、膀胱移行細(xì)胞癌[15]、胃癌[16]、肺癌[17]、口腔癌[18]、白血病[19]等，且在它們的病程發(fā)生發(fā)展、預(yù)后中起重要作用。然而，EZH2在LSCC發(fā)生發(fā)展過程中的生物學(xué)作用研究在國內(nèi)外還極為少見。本研究中LSCC組EZH2呈高表達(dá)，與組織學(xué)分級、T分級、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。相關(guān)性分析顯示LSCC中EZH2陽性組CD31-MVD值明顯高于陰性組、CD31-MVD計數(shù)與EZH2呈正相關(guān)，表明EZH2與LSCC血管生成有關(guān)。生存分析顯示LSCC中EZH2蛋白高表達(dá)預(yù)示著患者生存期短、預(yù)后較差。

全組61例LSCC總3年生存率83.71%，5年生存率70.49%。生存分析顯示，CD31-MVD值增加，LSCC總生存率則隨之下降，CD31-MVD計數(shù)各組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，表明CD31-MVD高，預(yù)示患者生存期短。61例LSCC患者>5年、≤5年兩組之間EZH2蛋白表達(dá)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，EZH2蛋白表達(dá)高，則患者生存期短。在Cox多因素分析中，CD31-MVD、EZH2、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、有無復(fù)發(fā)是預(yù)后獨立影響因素，EZH2、CD31表達(dá)高，提示LSCC預(yù)后差。

綜上所述，EZH2蛋白在LSCC中表達(dá)上調(diào)，促進LSCC新生血管生成、發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后。這與EZH2可促進血管生成的機制及癌組織侵襲轉(zhuǎn)移相一致[20]。進一步研究、開發(fā)EZH2分子抑制劑可為LSCC的治療提供新的分子靶點和理論依據(jù)，為LSCC患者帶來了新的福音。