董聰 高慶華 王玥 羅同陽(yáng)

（河北省科學(xué)院微生物研究所，保定 071051）

FAD 依賴(lài)的葡萄糖脫氫酶（FAD-dependent glucose dehydrogenase，簡(jiǎn)稱(chēng) FAD-GDH，EC 1.1.99.10），同葡萄糖氧化酶、吡喃糖脫氫酶、膽堿脫氫酶和甲醇氧化酶一樣都屬于 GMC 氧化還原酶（Glucosemethanol-choline-oxidoreductase） 家 族［1］。 它 是 以FAD 為輔基能夠在 NAD（P）+等存在的情況下催化β-D-葡萄糖生成 D-葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯，而 D-葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯會(huì)自發(fā)形成葡萄糖酸。

研究表明，F(xiàn)AD-GDH是一類(lèi)重要的臨床檢測(cè)和工業(yè)用酶，可應(yīng)用于血糖試紙或葡萄糖生物傳感器的制備、輔酶的再生、新型燃料電池［2］和心臟起搏器［3］的研制等。尤其是可以作為血糖檢測(cè)用酶，F(xiàn)AD-GDH不以氧氣作為酶促反應(yīng)的電子受體，檢測(cè)結(jié)果更準(zhǔn)確，且具有轉(zhuǎn)化率高、底物特異性好等優(yōu)點(diǎn)，因此有很大的應(yīng)用前景。

雖然到目前為止已經(jīng)有不少FAD-GDH被分離和鑒定，但是針對(duì)特定FAD-GDH全面深入的研究很少，主要原因是FAD-GDH很難實(shí)現(xiàn)可溶的重組表達(dá)，在大腸桿菌進(jìn)行重組表達(dá)時(shí)形成包涵體，不易分離純化。重組表達(dá)是克服這一障礙的有效方法。在真核表達(dá)系統(tǒng)，畢赤酵母中有過(guò)實(shí)現(xiàn)可溶表達(dá)，得到有活性的FAD-GDH的報(bào)道［4］。畢赤酵母（P. pastoris）表達(dá)系統(tǒng)在進(jìn)行外源基因表達(dá)時(shí)，具有生長(zhǎng)周期短、可進(jìn)行胞外分泌表達(dá)、目的蛋白易于純化和易于高密度發(fā)酵培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)［5-7］。由于畢赤酵母對(duì)密碼子的偏愛(ài)性，目的基因的密碼子序列對(duì)產(chǎn)物的表達(dá)量也有很大影響。大量研究表明，密碼子優(yōu)化對(duì)提高產(chǎn)物表達(dá)量有明顯的作用［8-13］。因此，如果想提高產(chǎn)物的產(chǎn)量，不但要優(yōu)化表達(dá)條件，還需要對(duì)密碼子進(jìn)行優(yōu)化，以期為FAD依賴(lài)的葡萄糖脫氫酶進(jìn)一步擴(kuò)大生產(chǎn)提供理論和技術(shù)支持，使其更好的應(yīng)用于血糖檢測(cè)及其他相關(guān)領(lǐng)域［14］。

本研究以NCBI上登錄號(hào)為XM_001216916的土曲霉NIH2624基因?yàn)榛A(chǔ)，根據(jù)畢赤酵母的密碼子偏愛(ài)性對(duì)該基因的密碼子進(jìn)行優(yōu)化，然后委托公司進(jìn)行基因合成。接著將該基因克隆到畢赤酵母中，并在基因的3′端接上6個(gè)組氨酸標(biāo)簽的核苷酸序列，以便于重組表達(dá)蛋白的純化。經(jīng)過(guò)篩選和優(yōu)化，得到了高產(chǎn)該FAD-GDH的重組菌株。采用該菌株摸索發(fā)酵條件，實(shí)現(xiàn)了該蛋白的高效表達(dá)，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 FAD依賴(lài)葡萄糖脫氫酶基因由安徽通用生物公司合成，合成的基因連接在pUC57T載體上；大腸桿菌DH5α購(gòu)自上海生工；酵母表達(dá)菌株X33由中科院微生物研究所提供；質(zhì)粒pMD由本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建。

1.1.2 酶和主要試劑EcoR I、NotI和SacI限制性?xún)?nèi)切酶為NEB公司產(chǎn)品；T4 DNA連接酶為T(mén)hermo公司產(chǎn)品；DNA Marker、DNA凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒DNA小提試劑盒為天根生化科技有限公司產(chǎn)品；G418為Sigma公司產(chǎn)品；2，6-二氯靛酚鈉（DCIP）為BBL Life Sciences公司產(chǎn)品，BeyoGoldTMHis-tag Purification Resin為碧云天生物科技有限公司產(chǎn)品；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.1.3 培 養(yǎng) 基 LB、YPD、YPDS、YPCS、BMGY和基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基等培養(yǎng)基配方和X33培養(yǎng)條件參照文獻(xiàn)［14］。

1.2 方法

1.2.1 葡萄糖脫氫酶密碼子優(yōu)化及人工合成 以NCBI 上登錄號(hào)為 XM_001216916 的土曲霉 NIH2624基因?yàn)榛A(chǔ)，根據(jù)畢赤酵母的密碼子偏愛(ài)性對(duì)該基因的密碼子進(jìn)行優(yōu)化，利用密碼子優(yōu)化軟件http：//www.jcat.de/分析，發(fā)現(xiàn)蛋白酶基因中有多處是畢赤酵母的稀有密碼子，利用密碼子優(yōu)化軟件http：//www.jcat.de/，對(duì)蛋白酶基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，在不改變氨基酸序列的前提下，獲得優(yōu)化后的蛋白酶的基因序列。利用信號(hào)肽預(yù)測(cè)服務(wù)器SignalP，服務(wù)器網(wǎng)址http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/，預(yù)測(cè)信號(hào)肽，然后去除，在序列的5′ 端加上EcoR I酶切位點(diǎn)，3′端加上6個(gè)組氨酸標(biāo)簽后再加NotI酶切位點(diǎn)。然后將優(yōu)化構(gòu)建的基因序列送安徽通用生物公司合成，合成的基因連接在pUC57T載體上。

1.2.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建 人工合成的pUC57-GDH和載體pMD經(jīng)EcoR I和NotI雙酶切后切膠回收純化，然后用T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，在含氨芐的LB平板上篩選陽(yáng)性克隆，對(duì)陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒進(jìn)一步進(jìn)行酶切驗(yàn)證，由安徽通用生物公司進(jìn)行測(cè)序分析。

1.2.3 陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的獲得 構(gòu)建好的重組表達(dá)載體pMD-GDH經(jīng)SacI線性化后電轉(zhuǎn)表達(dá)宿主P. pastorisX33感受態(tài)細(xì)胞，電轉(zhuǎn)條件：4 Kv，3 ms，然后快速加入1 mL 預(yù)冷YPDS液體培養(yǎng)基，于30℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)2-6 h，涂布在終濃度為250 μg/mL G418的YPD平板上，3 d后獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。

1.2.4 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將重組菌株X33/pMDGDH挑取單菌落接種于5 mL YPCS試管培養(yǎng)基中，14-18 h后加 1%（V/V）甲醇，之后24 h和48 h后均各加 1%（V/V）甲醇誘導(dǎo)，72 h收菌，8 000 r/min離心 5 min收集上清，測(cè)定酶活。至少重復(fù)3次。

1.2.5 FAD依賴(lài)葡萄糖脫氫酶的酶活測(cè)定 FAD依賴(lài)葡萄糖脫氫酶的酶活測(cè)定方法參照文獻(xiàn)［4］，使用DCIP作為電子受體，在30℃反應(yīng)180 s，測(cè)定520nm的吸光值變化。

1.2.6 FAD依賴(lài)葡萄糖脫氫酶酶學(xué)性質(zhì)分析 酶的最適作用溫度和pH 以及熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性測(cè)定、金屬離子的影響及底物特異性參照文獻(xiàn)［14］。所用的緩沖液均為pH 5.2的磷酸鹽緩沖液。

1.2.7 10 L發(fā)酵罐放大表達(dá)FAD-GDH 選取試管水平上FAD依賴(lài)的葡萄糖脫氫酶活性最高的轉(zhuǎn)化子，在10 L 發(fā)酵罐條件下進(jìn)行FAD-GDH 的表達(dá)。挑單克隆接種于YPD培養(yǎng)基培養(yǎng)10 h，按3%接種量轉(zhuǎn)接于 100 mL BMGY 培養(yǎng)基至OD600≈6 接種于10 L發(fā)酵罐，初期裝液量為 5.6 L BSM 培養(yǎng)基，高壓滅菌20 min 后，以 10%發(fā)酵體積接種。期間每隔24h加維生素C水溶液（終濃度80 μg/L），28℃培養(yǎng)，每12 h取樣測(cè)定發(fā)酵液酶活；上清液進(jìn)行10% 聚丙烯酰胺凝膠電泳，觀察FAD-GDH 蛋白質(zhì)的表達(dá)。具體方法參照文獻(xiàn)［15］。

2 結(jié)果

2.1 FAD依賴(lài)葡萄糖脫氫酶密碼子優(yōu)化

主要優(yōu)化指標(biāo)為CAI、密碼子使用相對(duì)分布、GC含量、酶切位點(diǎn)等，在不改變氨基酸序列的前提下，在這段優(yōu)化的密碼子序列中，共替換了416個(gè)堿基，優(yōu)化后的密碼子序列幾乎全部是畢赤酵母的偏愛(ài)密碼子，為目的基因在畢赤酵母中成功表達(dá)提供了保障?；蛐蛄腥鐖D1 所示。

2.2 酵母表達(dá)載體pMD-GDH的構(gòu)建

將人工合成包含目的基因的載體和pMD載體分別利用EcoR I和NotI雙酶切，并且利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的片段和表達(dá)載體片段，然后利用T4 DNA連接酶將目的片段連接到表達(dá)載體上，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α中，通過(guò)提取質(zhì)粒，EcoR I/NotI雙酶切鑒定質(zhì)粒的正確性（圖2）。有 1.7 kb左右的條帶，說(shuō)明FAD-GDH基因連接到了pMD載體上，然后將pMD-GDH質(zhì)粒送華大基因測(cè)序，測(cè)序結(jié)果說(shuō)明目的基因已連接到載體上，且序列正確。

2.3 陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的獲得

將酶切正確的重組質(zhì)粒pMD-GDH進(jìn)行SacI線性化后電轉(zhuǎn)表達(dá)宿主Pichia pastorisX33，構(gòu)建重組菌X33/pMD-GDH，涂布在終濃度為250 μg/mL G418的YPD平板上，3 d后獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子（圖3）。

將重組菌株X33/pMD-GDH挑取單菌落接種于5 mL YPCS試管培養(yǎng)基中，14-18 h后加 1%（V/V）甲醇，之后24 h和48 h后均各加 1%（V/V）甲醇誘導(dǎo)，96 h收菌，8 000 r/min離心 5 min收集上清，上清液利用DCIP的方法測(cè)定 FAD 依賴(lài)葡萄糖脫氫酶的活力，酶活定義為反應(yīng)體系中每分鐘反應(yīng)1 μmol電子受體所需的酶量，并以此來(lái)確定重組子是否為陽(yáng)性。共挑取了18個(gè)單菌落誘導(dǎo)培養(yǎng)，測(cè)定酶活，重復(fù)3次，其中9號(hào)酶活較高且穩(wěn)定（圖4），試管中酶活為20.85 U/mL，選其做進(jìn)一步的研究。

2.4 SDS-PAGE電泳分析

將在試管中誘導(dǎo)表達(dá)收集的酶液經(jīng)超濾濃縮后進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定，結(jié)果如圖5所示，重組畢赤酵母在60-70 kD之間有一條條帶，與理論分子量相符，而pMD空載轉(zhuǎn)化的酵母沒(méi)有類(lèi)似的條帶。并且用DCIP法測(cè)定發(fā)酵液有活性，說(shuō)明FAD依賴(lài)的葡萄糖脫氫酶在酵母體內(nèi)實(shí)現(xiàn)了分泌表達(dá)。該基因3′端有His-tag序列，可通過(guò)與鎳離子的親和層析進(jìn)行純化，經(jīng)BeyoGoldTMHis-tag Purification Resin純化后SDS-PAGE分析結(jié)果如圖6所示。

2.5 FAD依賴(lài)的葡萄糖脫氫酶酶學(xué)性質(zhì)分析

酶學(xué)性質(zhì)分析結(jié)果如圖7-圖9所示，畢赤酵母表達(dá)的FAD-GDH最適反應(yīng)溫度為55℃，在50℃下處理150 min仍有70%的活性。FAD-GDH的最適pH值為7.0，在 pH 4-7 范圍內(nèi)，37℃保溫4 h，F(xiàn)AD-GDH 仍能保持 50%以上的活性。金屬離子Cu2+對(duì)酶活抑制作用比較大。FAD-GDH的底物專(zhuān)一性較好，以葡萄糖為最適底物。當(dāng)以木糖為底物時(shí)，其相對(duì)活性是以葡萄糖為底物的36%；對(duì)麥芽糖和海藻糖也有一定活性，對(duì)其他單糖或二糖不顯示催化活性。

圖1 優(yōu)化后的FAD-GDH基因序列

2.6 10 L發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)

重組菌P. pastorispMD-GDH在10 L發(fā)酵罐的放大培養(yǎng)，在菌體生長(zhǎng)階段當(dāng)溶氧DO值在20 h迅速上升（培養(yǎng)基甘油耗盡）時(shí)以恒速補(bǔ)加甘油4 h，饑餓培養(yǎng)0.5 h 后開(kāi)始甲醇誘導(dǎo)。在甲醇誘導(dǎo)階段，通過(guò)控制DO 值來(lái)流加甲醇以高效誘導(dǎo)重組畢赤酵母產(chǎn)酶，同時(shí)可避免過(guò)高的甲醇對(duì)菌體產(chǎn)生毒害作用，甲醇流加［6 mL/（h·L）］與DO 偶聯(lián)，即DO 值高于0%時(shí)補(bǔ)加甲醇，維持DO 0%左右。隨著甲醇添加，F(xiàn)AD依賴(lài)葡萄糖脫氫酶酶活不斷提升，甲醇誘導(dǎo)136 h時(shí)酶活達(dá)到257.6 U/mL（圖10）。此外，對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)的發(fā)酵上清液進(jìn)行SDS-PAGE 電泳分析，結(jié)果顯示各上清液在SDS-PAGE 圖中有一條清晰條帶，該條帶隨發(fā)酵時(shí)間增加而變得濃重清晰，表明發(fā)酵上清液中FAD依賴(lài)的葡萄糖脫氫酶含量隨著發(fā)酵時(shí)間增加而顯著提高，與酶活增長(zhǎng)趨勢(shì)保持一致。

圖2 pMD-GDH載體雙酶切鑒定

圖3 X33/pMD-GDH單菌落

圖4 高產(chǎn)FAD依賴(lài)葡萄糖脫氫酶重組畢赤酵母的試管篩選

圖5 重組蛋白的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果

圖6 重組蛋白純化結(jié)果

圖7 FAD-GDH 酶學(xué)性質(zhì)

圖8 不同金屬離子對(duì) FAD-GDH 的影響

圖9 FAD-GDH 的底物特異性

圖10 上罐發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

3 討論

FAD依賴(lài)的葡萄糖脫氫酶作為血糖檢測(cè)用酶有很大的應(yīng)用前景，但是在天然宿主菌中的表達(dá)量很低，在大腸桿菌進(jìn)行重組表達(dá)時(shí)形成包涵體，表達(dá)量低，不易分離［16］，給FAD依賴(lài)的葡萄糖脫氫酶的工業(yè)應(yīng)用帶來(lái)一定的限制，所以利用基因工程技術(shù)實(shí)現(xiàn)FAD依賴(lài)的葡萄糖脫氫酶的高效表達(dá)成了目前研究的重點(diǎn)。酵母表達(dá)系統(tǒng)作為一種真核表達(dá)系統(tǒng)，與原核表達(dá)系統(tǒng)相比，具有很多優(yōu)勢(shì)，如生長(zhǎng)速度快，可使用高效的AOX 啟動(dòng)子以及可實(shí)現(xiàn)異源蛋白的分泌表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于各種具有工業(yè)用途的重組蛋白的生產(chǎn)［58，17］。

本實(shí)驗(yàn)利用酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)FAD依賴(lài)葡萄糖脫氫酶，通過(guò)分析影響表達(dá)量的因素，根據(jù)畢赤酵母對(duì)密碼子的偏愛(ài)性對(duì)該基因序列進(jìn)行了優(yōu)化［18］，提高其表達(dá)量。蛋白酶?jìng)鹘y(tǒng)分離純化方法多采用超濾-陽(yáng)離子柱-超濾-陰離子柱等步驟，工藝復(fù)雜，收率低。本研究在FAD依賴(lài)葡萄糖脫氫酶基因3′端加上了6 個(gè)組氨酸標(biāo)簽，可以通過(guò)親和層析的方法進(jìn)行純化，效率高，適合大規(guī)模純化。

在已有的報(bào)道中，杉木炭疽病菌來(lái)源的 FADGDH 在畢赤酵母中得到了較好的表達(dá)，通過(guò)采用 7 L 的發(fā)酵罐，發(fā)酵約 50.5 h，產(chǎn)量達(dá)到 48 000 U/L報(bào)道［14］。本實(shí)驗(yàn)利用酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)FAD依賴(lài)的葡萄糖脫氫酶，通過(guò)優(yōu)化FAD依賴(lài)的葡萄糖脫氫酶密碼子序列，在10 L發(fā)酵罐培養(yǎng)時(shí)經(jīng)過(guò)136 h誘導(dǎo)培養(yǎng)，酶活達(dá)到257 600 U/L，是現(xiàn)有技術(shù)中報(bào)道的酶活的5.3倍。畢赤酵母可通過(guò)高密度發(fā)酵培養(yǎng)大量生產(chǎn)重組蛋白，在提高產(chǎn)量的同時(shí)有利于簡(jiǎn)化純化步驟，降低生產(chǎn)成本。

酶學(xué)性質(zhì)是表征一個(gè)酶的基本參數(shù)，通過(guò)酶學(xué)性質(zhì)的測(cè)定和評(píng)估，可以了解一個(gè)酶的特有性質(zhì)，為酶的應(yīng)用和改造提供一系列必要的初始參數(shù)。在血糖檢測(cè)用酶中，要求所用的酶有較高的催化效率，較窄的底物譜，良好的熱穩(wěn)定性［19］。周利偉等［14］報(bào)道的重組FAD-GDH最適溫度為40℃，本研究畢赤酵母重組表達(dá)FAD-GDH的最適反應(yīng)溫度為55℃，且熱穩(wěn)定性良好，在50℃下處理150 min仍有70%的活性；其次該酶的最適pH值為7.0，在 pH4-7 范圍內(nèi)，37℃保溫4 h，F(xiàn)AD-GDH 仍能保持 50%以上的活性，有較高的應(yīng)用價(jià)值。金屬離子Cu2+對(duì)該酶活抑制作用比較大，與前人研究結(jié)果一致。FADGDH的底物專(zhuān)一性較好，以葡萄糖為最適底物。當(dāng)以木糖為底物時(shí)，其相對(duì)活性是以葡萄糖為底物的36%；對(duì)麥芽糖和海藻糖也有一定活性，與楊愈豐等［20］研究結(jié)果相符，對(duì)其他單糖或二糖不顯示催化活性。

4 結(jié)論

本研究以 NCBI 上登錄號(hào)為 XM_001216916 的土曲霉 NIH2624 基因?yàn)榛A(chǔ)，根據(jù)畢赤酵母的密碼子偏愛(ài)性對(duì)該基因的密碼子進(jìn)行優(yōu)化，將該基因克隆到畢赤酵母中，經(jīng)過(guò)篩選和優(yōu)化，得到了高產(chǎn)FAD-GDH 的重組菌株。試管水平酶活達(dá)到20 850 U/L；在10 L發(fā)酵罐培養(yǎng)時(shí)經(jīng)過(guò)136 h誘導(dǎo)培養(yǎng)，酶活達(dá)到257 600 U/L，是現(xiàn)有報(bào)道中酶活的5.3倍。然后研究了其酶學(xué)性質(zhì)，pH、溫度穩(wěn)定性和底物專(zhuān)一性較好。