肖冰 羅云波，2 黃昆侖，2 張園 許文濤，2

（1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2. 農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)（食用）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083）

目前待檢物質(zhì)種類繁多，樣品復(fù)雜，針對(duì)不同待檢物質(zhì)的定量檢測(cè)方法不一。檢測(cè)重金屬離子采用的主要方法是原子吸收法［1］、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法［2］及電感耦合等離子體質(zhì)譜［3］等；針對(duì)農(nóng)藥、生物毒素、食品添加劑等污染物的檢測(cè)主要是采用液相色譜［4］、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等方法［5］、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)法，各種傳統(tǒng)定量檢測(cè)方法可以準(zhǔn)確測(cè)定目標(biāo)檢測(cè)物的含量，但無(wú)法對(duì)不同種類的待檢物質(zhì)進(jìn)行統(tǒng)一的檢測(cè)，而功能核酸的出現(xiàn)與其相關(guān)技術(shù)的發(fā)展可有效地解決這一問(wèn)題。功能核酸作為一類具有特定空間構(gòu)象、執(zhí)行特異生物功能的天然或者人工核酸序列，可以將各種待檢物質(zhì)統(tǒng)一轉(zhuǎn)化為核酸信號(hào)再結(jié)合功能核酸相關(guān)檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。另外，還具有易于修飾、價(jià)格低廉、穩(wěn)定性高及特異性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)。功能核酸檢測(cè)技術(shù)分為靶標(biāo)識(shí)別、信號(hào)轉(zhuǎn)換輸出兩部分。信號(hào)輸出的方式包括比色信號(hào)、熒光信號(hào)、電化學(xué)信號(hào)、化學(xué)發(fā)光信號(hào)、熱信號(hào)及動(dòng)力學(xué)信號(hào)等。

其中，熒光傳感具有靈敏度高、特異性強(qiáng)以及可進(jìn)行實(shí)時(shí)原位檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)，而標(biāo)記型熒光傳感又是熒光傳感中最重要的一部分，結(jié)合功能核酸后，更擴(kuò)大和增強(qiáng)了其檢測(cè)靈敏度、檢測(cè)范圍與檢測(cè)效率［6-7］，逐漸被廣泛應(yīng)用于食品安全、環(huán)境污染、疾病診斷相關(guān)多種靶標(biāo)物質(zhì)的檢測(cè)［8］。功能核酸在功能核酸熒光標(biāo)記型定量統(tǒng)一化檢測(cè)技術(shù)中起到的重要作用主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面，一是可將多種靶物質(zhì)統(tǒng)一轉(zhuǎn)為較為穩(wěn)定的核酸信號(hào)，使現(xiàn)有的熒光檢測(cè)的可檢靶物質(zhì)種類增多，擴(kuò)大檢測(cè)范圍；二是由于功能核酸本身可擴(kuò)增的性質(zhì)，可以在定量檢測(cè)中加入信號(hào)擴(kuò)增，使得檢測(cè)靈敏度以及檢測(cè)效率大大增強(qiáng)。

不同的熒光標(biāo)記型材料與功能核酸結(jié)合后具有不同的發(fā)光、猝滅性質(zhì)，其發(fā)光機(jī)制也不盡相同，本文針對(duì)不同熒光物質(zhì)與功能核酸結(jié)合的特點(diǎn)將功能核酸熒光標(biāo)記型定量統(tǒng)一化檢測(cè)技術(shù)分為熒光標(biāo)記型線性功能核酸探針介導(dǎo)的熒光定量檢測(cè)技術(shù)，熒光標(biāo)記型非線性功能核酸探針介導(dǎo)的熒光定量檢測(cè)技術(shù)，熒光標(biāo)記型功能核酸雙探針介導(dǎo)的熒光定量檢測(cè)技術(shù)，并從這幾個(gè)角度對(duì)功能核酸熒光標(biāo)記型定量統(tǒng)一化檢測(cè)技術(shù)與其實(shí)際應(yīng)用進(jìn)行了分類介紹與評(píng)價(jià)對(duì)比，最后討論了該技術(shù)在多種風(fēng)險(xiǎn)因子分析中的研究意義以及存在的問(wèn)題，并為其未來(lái)的發(fā)展方向與應(yīng)用前景作出展望。

1 功能核酸熒光標(biāo)記型定量統(tǒng)一化檢測(cè)技術(shù)概述及其分類

熒光定量檢測(cè)技術(shù)是以紫外或可見(jiàn)光作為激發(fā)光源，照射處于基態(tài)的分子，使其吸收能量，躍遷至激發(fā)態(tài)，進(jìn)而由于激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定激發(fā)態(tài)物質(zhì)分子返回基態(tài)過(guò)程會(huì)散失部分能量，這部分能量轉(zhuǎn)化光能，這種光被稱為熒光，即可利用與檢測(cè)的熒光信號(hào)［9-10］。熒光定量檢測(cè)技術(shù)廣義上是由識(shí)別部分、轉(zhuǎn)化部分以及熒光物質(zhì)部分構(gòu)成，其檢測(cè)原理是待檢測(cè)物被識(shí)別部分與轉(zhuǎn)化部分特異性識(shí)別、結(jié)合、相互作用并轉(zhuǎn)化為可引起熒光物質(zhì)敏感的信號(hào)［11］，進(jìn)而導(dǎo)致其光物理性質(zhì)發(fā)生變化，主要包括熒光的增強(qiáng)、淬滅和光譜位移等。

通常，在熒光標(biāo)記型功能核酸介導(dǎo)的熒光定量檢測(cè)系統(tǒng)的構(gòu)建過(guò)程中，需要在核酸分子上面標(biāo)記熒光物質(zhì)，這些用于標(biāo)記的熒光物質(zhì)可分為熒光素類［12-13］、羅丹明類［14-15］、氟硼類染料（BODIPY）［16］、香豆素類［17］、萘酰亞胺、芘類［18-19］、萘類［20］、蒽類及新型熒光物質(zhì)等，根據(jù)檢測(cè)對(duì)象的特點(diǎn)選擇不同的熒光報(bào)告基團(tuán)以共價(jià)鍵形式標(biāo)記在核酸上，這些被熒光標(biāo)記后的核酸分子作為核酸分子熒光探針在生物傳感過(guò)程中起到分子識(shí)別以及熒光信號(hào)報(bào)告等功能，根據(jù)其熒光發(fā)光特點(diǎn)可以將熒光標(biāo)記型功能核酸介導(dǎo)的熒光生物傳感技術(shù)分為L(zhǎng)ight-up（點(diǎn)亮型）探針介導(dǎo)的熒光定量檢測(cè)技術(shù)、Scorpions primer（蝎子型）探針介導(dǎo)的熒光定量檢測(cè)技術(shù)等。

2 標(biāo)記型熒光定量檢測(cè)技術(shù)幾種重要發(fā)光機(jī)制以及與核酸結(jié)合的典型應(yīng)用

2.1 熒光共振能量轉(zhuǎn)移

熒光共振能量轉(zhuǎn)移（Fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）是指一個(gè)體系含有能量供體與能量受體兩個(gè)熒光團(tuán)，在供體被激發(fā)后可以向受體發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，進(jìn)而受體發(fā)出熒光［21］。該機(jī)理對(duì)供體和受體的激發(fā)和發(fā)射光譜、兩者間的距離和排列方式皆有一定要求［22-23］，可應(yīng)用于多種形式的熒光探針中。例如，Shamsipur等［24］基于熒光與猝滅基團(tuán)的熒光共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，開(kāi)發(fā)了一種熒光探針介導(dǎo)的針對(duì)目標(biāo)靶序列檢測(cè)的生物傳感器（圖1-A）。

2.2 π-π堆積激發(fā)態(tài)締合物/復(fù)合物的形成

激發(fā)態(tài)締合物（Excimer，簡(jiǎn)稱Er）和激發(fā)態(tài)復(fù)合物（Exicplex，簡(jiǎn)稱Ex）分別指激發(fā)態(tài)熒光基團(tuán)與相同的和不同的基態(tài)熒光基團(tuán)復(fù)合。激發(fā)態(tài)復(fù)合物與締合物的發(fā)射光譜與基態(tài)相比，會(huì)產(chǎn)生紅移，同時(shí)其發(fā)射峰呈現(xiàn)強(qiáng)而寬且無(wú)精細(xì)結(jié)構(gòu)的狀態(tài)。蒽（anthracene）［25-26］和芘（pyrene）［27］等多環(huán)芳烴熒光團(tuán)常用于此類探針的設(shè)計(jì)。例如，末端標(biāo)有芘分子核酸發(fā)卡探針常被設(shè)計(jì)到高靈敏檢測(cè)靶標(biāo)物質(zhì)的熒光定量檢測(cè)技術(shù)中［28-29］。

2.3 聚集誘導(dǎo)發(fā)光

基于聚集誘導(dǎo)發(fā)光（Aggregation-Induced emission，AIE）的熒光分子是一類具有螺旋結(jié)構(gòu)的分子，具有游離狀態(tài)不發(fā)熒光，聚集狀態(tài)發(fā)生較強(qiáng)熒光的性質(zhì)［30］。具體機(jī)理是當(dāng)這類分子以單體游離態(tài)被激發(fā)光激發(fā)后，被激發(fā)電子以分子內(nèi)振動(dòng)旋轉(zhuǎn)形式回到基態(tài)，不產(chǎn)生熒光；聚集時(shí)，被激發(fā)的電子無(wú)法通過(guò)分子內(nèi)振動(dòng)旋轉(zhuǎn)釋放能量回到基態(tài)，而通過(guò)輻射方式釋放多余能量，產(chǎn)生熒光。該類熒光分子可以很巧妙的結(jié)合分子溶解性來(lái)進(jìn)行熒光傳感策略的設(shè)計(jì)，具有信噪比高、抗漂白能力強(qiáng)的特點(diǎn)［31］（圖 1-B）。

2.4 上轉(zhuǎn)換發(fā)光

上轉(zhuǎn)換納米材料（Upconversion luminescence，UCL）具有優(yōu)異的光學(xué)性能，它能克服傳統(tǒng)發(fā)光材料的多種不足，尤其是其激發(fā)波長(zhǎng)位于近紅外區(qū)，可以將低頻率激發(fā)光轉(zhuǎn)換成高頻率發(fā)射光，即吸收多個(gè)低能光子使其到達(dá)高的激發(fā)態(tài)并最終發(fā)射出一個(gè)高能光子的現(xiàn)象，也稱為多光子發(fā)光。以UCNPs作為標(biāo)記材料可有效避免生物樣品的自體熒光和光散射，大大提高了檢測(cè)的靈敏度，UCNPs與DNA分子相結(jié)合可構(gòu)建DNA熒光納米探針，在生物領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力［33］。2006年，Wang等［34］利用Yb3+/Er3+離子對(duì)共摻NaYF4納米晶體，并結(jié)合磁場(chǎng)力分離技術(shù)對(duì)靶標(biāo)DNA進(jìn)行檢測(cè)。

2.5 光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移

光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移（Photo-induced electron transfer，PET）［35］是指電子給體或電子受體的電荷在激發(fā)光的作用下發(fā)生電子給予或者電子接收的過(guò)程，該過(guò)程會(huì)阻礙熒光基團(tuán)的電子從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)的過(guò)程，引起熒光淬滅，若結(jié)合待檢測(cè)物質(zhì)時(shí)，熒光團(tuán)被氧化或還原，可以阻止光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移過(guò)程，使得熒光團(tuán)恢復(fù)熒光，常用于熒光增強(qiáng)型傳感器設(shè)計(jì)，Nagano課題組就基于PET過(guò)程構(gòu)建了可以識(shí)別一氧化氮及單線態(tài)氧的熒光探針（圖1-C）。

2.6 分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移

分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移，也稱作光致電荷轉(zhuǎn)移（Photoinduced charge transfer，PCT）指分子在激發(fā)光的激發(fā)下，電子在分子內(nèi)部發(fā)生轉(zhuǎn)移，形成正負(fù)電荷分離的狀態(tài)［36］。熒光物質(zhì)以耦合形式連接著給電子和吸電子集團(tuán)，π鍵可作為電子轉(zhuǎn)移通道，其中電子所受的力越強(qiáng)，分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移效益就越強(qiáng)，熒光強(qiáng)度越強(qiáng)，光譜波長(zhǎng)越長(zhǎng)，當(dāng)待檢測(cè)物分別與吸電子基團(tuán)和給電子基團(tuán)結(jié)合時(shí)，分別會(huì)使分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移效應(yīng)增強(qiáng)和減弱，光譜波長(zhǎng)紅移和藍(lán)移。例如，圖1-D分子探針的識(shí)別基團(tuán)是其電子受體，分子中的氮雜冠醚與二甲氨基都是電子給體，冠醚和鈣離子絡(luò)合后，冠醚吸電子能力顯著變強(qiáng)，熒光隨之紅移。

2.7 化學(xué)發(fā)光

化學(xué)發(fā)光（Chemical emission）是指物質(zhì)在進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中發(fā)生的一種光輻射現(xiàn)象。兩種可發(fā)生自發(fā)反應(yīng)的物質(zhì)反應(yīng)后所釋放的能量激發(fā)另一類物質(zhì)從基態(tài)躍遷至激發(fā)態(tài)，部分能量以輻射形式釋放出來(lái)，形成熒光。例如，圖1-E反應(yīng)型汞離子分子熒光探針在溶液中與汞離子結(jié)合后其熒光強(qiáng)度增至34倍之多，并伴隨有光譜紅移，經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)反應(yīng)后可得到脫硫化合物。

3 熒光標(biāo)記型線性功能核酸探針介導(dǎo)的熒光定量檢測(cè)技術(shù)

這類核酸鏈標(biāo)記型功能核酸熒光定量檢測(cè)技術(shù)是基于標(biāo)記熒光基團(tuán)或猝滅基團(tuán)的線性單鏈核酸探針。其原理是在靶標(biāo)物質(zhì)的介導(dǎo)下，核酸探針結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，引起熒光基團(tuán)與核酸探針或者熒光基團(tuán)與猝滅基團(tuán)間距離、狀態(tài)的變化，再導(dǎo)致熒光信號(hào)的變化，通過(guò)檢測(cè)這種熒光信號(hào)的變化定量檢測(cè)靶標(biāo)物質(zhì)，該類熒光定量檢測(cè)技術(shù)可分為L(zhǎng)ight-up（點(diǎn)亮型）探針介導(dǎo)型、線性單標(biāo)記探針介導(dǎo)型與線性雙標(biāo)記探針介導(dǎo)型等典型類型。

圖1 熒光共振能量轉(zhuǎn)移（A）聚集誘導(dǎo)發(fā)光（B）光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移（C）分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（D）化學(xué)發(fā)光（E）機(jī)理圖

3.1 Light-up（點(diǎn)亮型）探針介導(dǎo)的熒光定量檢測(cè)技術(shù)

Light-up探針是一種單標(biāo)記型核酸探針，可應(yīng)用于定量PCR中，其特性是，游離狀態(tài)時(shí)，該類探針中不對(duì)稱花青染料噻唑橙，其中，兩個(gè)芳香族體系可以圍繞相互連接的亞甲基旋轉(zhuǎn)，物質(zhì)從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)以旋轉(zhuǎn)動(dòng)能釋放多余能量，熒光微弱；芳香族部分被外力如結(jié)合另一條核酸鏈時(shí)，變?yōu)閹缀纹矫娼Y(jié)構(gòu)，分子內(nèi)無(wú)法旋轉(zhuǎn)，多余能量會(huì)以輻射能的形式釋放，轉(zhuǎn)為光能，熒光增強(qiáng)，該類熒光分子可以很巧妙的結(jié)合分子溶解性來(lái)進(jìn)行熒光傳感策略。Svanvik等［32］報(bào)道了一種以標(biāo)記有噻唑橙染料的7-9個(gè)堿基的肽核酸Light-up探針在實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)中的應(yīng)用，其選用的電中性核酸模擬物肽核酸比普通探針與靶DNA結(jié)合的更快更穩(wěn)定，在檢測(cè)時(shí)，將體系加入到實(shí)時(shí)普通PCR體系中，每輪擴(kuò)增過(guò)程后，在靶物質(zhì)存在時(shí)，熒光探針可與再次退火的熱變性模版競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，每次退火過(guò)程后在波長(zhǎng)是470 nm的激發(fā)光和波長(zhǎng)為530 nm的發(fā)射光的條件下進(jìn)行熒光強(qiáng)度的讀數(shù)，達(dá)到實(shí)時(shí)定量監(jiān)測(cè)PCR過(guò)程中產(chǎn)生的特定擴(kuò)增產(chǎn)物的目標(biāo)（圖2-A）。

3.2 線性單標(biāo)記探針介導(dǎo)的熒光定量檢測(cè)技術(shù)

這類核酸鏈標(biāo)記型功能核酸熒光定量檢測(cè)技術(shù)的檢測(cè)原理是基于單熒光基團(tuán)與單猝滅基團(tuán)的熒光共振轉(zhuǎn)移原理，通過(guò)所標(biāo)記的核酸結(jié)構(gòu)改變或通過(guò)核酸擴(kuò)增而改變淬滅基團(tuán)與熒光基團(tuán)的距離引起兩者間的熒光共振轉(zhuǎn)移現(xiàn)象的發(fā)生或停止，進(jìn)而引起熒光信號(hào)的變化。Li和Lu等［37］于2000年報(bào)道了一種用于檢測(cè)鉛離子的TAMRA單標(biāo)記功能核酸熒光定量檢測(cè)技術(shù)。該傳感器設(shè)計(jì)了一條5′端以共價(jià)鍵形式標(biāo)有TAMRA熒光基團(tuán)的20個(gè)堿基的8-17DNAzyme底物鏈（其中切割部位為一個(gè)RNA堿基）與一條3′端標(biāo)有Dabcyl猝滅基團(tuán)的含有34個(gè)堿基的8-17DNAzyme酶鏈，在沒(méi)有鉛離子存在以及解鏈溫度高于室溫的情況下，該條底物鏈會(huì)通過(guò)Waston-Crick鍵堿基對(duì)與其酶鏈相連，呈惰性。另外，在猝滅基團(tuán)的猝滅作用下體系成低熒光狀態(tài)。環(huán)境pH為6，當(dāng)鉛離子存在時(shí)，8-17DNAzyme被激活，催化切割底物鏈，使其接連溫度變低在室溫下呈不穩(wěn)定狀態(tài)，進(jìn)而標(biāo)有熒光基團(tuán)的底物鏈從酶鏈脫離，同時(shí)與標(biāo)有猝滅基團(tuán)的序列分離，熒光基團(tuán)重新發(fā)出熒光，熒光倍數(shù)為猝滅時(shí)的3-4倍，該種熒光的激發(fā)光波長(zhǎng)為560 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為580 nm。測(cè)試結(jié)果表明該種DNA傳感器的檢出限為10-8mol/L。此后，另一種鉛離子GR-5 DNAzyme也被應(yīng)用于熒光定量檢測(cè)技術(shù)并顯示出更好的選擇性（圖2-B）。

3.3 線性雙標(biāo)記探針介導(dǎo)的熒光定量檢測(cè)技術(shù)

為了提高線性標(biāo)記探針介導(dǎo)的熒光定量生物傳感器的相關(guān)性能，研究者引入一個(gè)以上的淬滅基團(tuán)建立了線性雙標(biāo)記探針介導(dǎo)的熒光定量檢測(cè)系統(tǒng)，以增加傳感器的猝滅效率，降低檢測(cè)系統(tǒng)的熒光背景值。Lan等［38］針對(duì)鉛離子檢測(cè)，設(shè)計(jì)了一種雙標(biāo)記功能核酸FAM熒光傳感器，其設(shè)計(jì)了一條5′ 端以共價(jià)鍵形式標(biāo)有FAM熒光基團(tuán)的含20個(gè)堿基的8-17DNAzyme底物鏈與一條3′ 端標(biāo)有Dabcyl猝滅基團(tuán)的含有34個(gè)堿基的8-17 DNAzyme酶鏈，并且在底物鏈的3′端加標(biāo)了一個(gè)猝滅基團(tuán)，以降低底物鏈未切割時(shí)的熒光背景值。該實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)條件為pH為 7.2的50 mmol/L HEPES的緩沖液，其原理與線性單標(biāo)記探針介導(dǎo)的熒光定量檢測(cè)技術(shù)相似，最適檢測(cè)溫度為15-25℃，檢出限為10-8mol/L（圖2-C）。

4 熒光標(biāo)記型非線性功能核酸探針介導(dǎo)的熒光定量檢測(cè)技術(shù)

這類核酸鏈標(biāo)記型功能核酸熒光定量檢測(cè)技術(shù)是基于標(biāo)記熒光基團(tuán)或猝滅基團(tuán)的非線性單鏈核酸探針，與熒光標(biāo)記型線性功能核酸介導(dǎo)的技術(shù)的主要區(qū)別在于體系內(nèi)核酸結(jié)構(gòu)的不同，呈發(fā)卡型、蝎子型等非線性形狀。其原理同樣是在靶標(biāo)物質(zhì)的介導(dǎo)下，核酸探針的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，引起熒光基團(tuán)與核酸探針或者熒光基團(tuán)與猝滅基團(tuán)間距離、狀態(tài)的變化，再導(dǎo)致熒光信號(hào)的改變，通過(guò)檢測(cè)這種熒光信號(hào)的變化定量檢測(cè)靶標(biāo)物質(zhì)。該類熒光定量檢測(cè)技術(shù)包括Scorpions primer探針介導(dǎo)型、Amplifluor primer（引物特異型）探針介導(dǎo)型與Hairpin Probe（發(fā)卡探針型）介導(dǎo)型等典型類型。

4.1 Scorpions primer（蝎子引物型）探針介導(dǎo)的熒光定量檢測(cè)技術(shù)

Scorpions primer是一種在5′端標(biāo)記有一段防止5′端延伸的核酸尾鏈的引物探針，這種探針可以與經(jīng)過(guò)引物探針尾部延伸的同體分子靶序列互補(bǔ)配對(duì)，因?yàn)樘结槨形镔|(zhì)的結(jié)合對(duì)二次退火和鏈內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu)的支持，這種分子內(nèi)部結(jié)合的速度縮短了反應(yīng)過(guò)程中的平衡時(shí)間，使得信號(hào)技術(shù)十分滿足快速檢測(cè)的要求。Whitcombe等［39］利用這種蝎子型自擴(kuò)增探針檢測(cè)了PCR產(chǎn)物，同樣，這種探針包含了由50個(gè)左右堿基，5′延伸部分，熒光猝滅分子對(duì)，以及一段自互補(bǔ)莖序列組成，這種蝎子型探針比普通探針與靶DNA結(jié)合的更快更穩(wěn)定。在檢測(cè)時(shí)，將體系加入到實(shí)時(shí)普通PCR體系中，每輪擴(kuò)增過(guò)程后，在靶物質(zhì)存在時(shí)，熒光探針可與再次退火的熱變性模版競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，每次退火過(guò)程后進(jìn)行熒光強(qiáng)度的讀數(shù)，達(dá)到熒光實(shí)時(shí)定量檢測(cè)的目的。

4.2 Amplifluor primer（引物特異型）探針介導(dǎo)的熒光定量檢測(cè)技術(shù)

Uehara等［40］介紹了一種基于引物特異型探針的熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理針對(duì)端粒酶閉管型檢測(cè)方法。該引物特異型探針包含了3′端和端粒重復(fù)靶序列互補(bǔ)配對(duì)的序列，5′端一個(gè)標(biāo)有熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)的發(fā)卡狀的41 nt長(zhǎng)的核酸序列，發(fā)卡結(jié)構(gòu)與端粒酶重復(fù)序列沒(méi)有同源部分，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。該實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)端粒酶重復(fù)序列對(duì)端粒酶活性進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)，在端粒酶具有活性時(shí)，隨著端粒酶的加入，底物序列的3′端開(kāi)始30℃延伸端粒酶重復(fù)序列30 min，接著加入引物特異型序列，進(jìn)行30 輪的94℃熱變性30 s和59℃的30 s PCR擴(kuò)增過(guò)程，當(dāng)其與端粒酶重復(fù)序列互補(bǔ)的序列段與端粒酶重復(fù)序列結(jié)合時(shí)，其發(fā)卡結(jié)構(gòu)打開(kāi)，熒光基團(tuán)與猝滅基團(tuán)被分離，發(fā)射熒光；當(dāng)端粒酶序列不存在時(shí)，引物特異性探針內(nèi)的發(fā)卡結(jié)構(gòu)保持發(fā)卡狀態(tài)，熒光基團(tuán)與猝滅基團(tuán)發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，熒光被猝滅，通過(guò)對(duì)后續(xù)PCR擴(kuò)增循環(huán)過(guò)程的熒光強(qiáng)度的監(jiān)測(cè)實(shí)現(xiàn)對(duì)端粒酶實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的目標(biāo)（圖2-D）。

4.3 Hairpin Probe（發(fā)卡探針型）介導(dǎo)的熒光定量檢測(cè)技術(shù)

為了提高標(biāo)記探針介導(dǎo)的熒光定量生物傳感器的相關(guān)性能，研究者將檢測(cè)系統(tǒng)中用到的功能核酸的結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化，加強(qiáng)底物鏈與酶鏈之間的結(jié)合率，降低檢測(cè)時(shí)的背景值。Wang和Nagraj等［41-42］將8-17 DNAzyme 酶鏈與底物鏈設(shè)計(jì)成一條發(fā)卡狀核酸鏈以加強(qiáng)其結(jié)合率，Wang等同時(shí)將FAM熒光基團(tuán)與猝滅基團(tuán)標(biāo)記于核酸鏈的兩端，該段探針包含60左右個(gè)堿基，其中包含10個(gè)連續(xù)的胸腺嘧啶，檢測(cè)條件為pH為 7.2的50 mmol/L HEPES緩沖液與100 mmol/L NaCl溶液，其原理與線性單標(biāo)記探針介導(dǎo)的熒光定量檢測(cè)技術(shù)相似，該傳感器的檢測(cè)限可達(dá)到2 nmol/L（圖 2-E，2-F）。

5 熒光標(biāo)記型功能核酸雙探針介導(dǎo)的熒光定量檢測(cè)技術(shù)

這類核酸鏈標(biāo)記型功能核酸熒光定量檢測(cè)技術(shù)是基于標(biāo)記熒光基團(tuán)或猝滅基團(tuán)的功能核酸雙探針，該種熒光標(biāo)記型功能核酸雙探針介導(dǎo)的熒光定量檢測(cè)技術(shù)最大的特點(diǎn)是在該體系中含有兩條熒光基團(tuán)或者猝滅基團(tuán)標(biāo)記的功能核酸探針，其原理是在靶標(biāo)物質(zhì)的介導(dǎo)下，兩條核酸探針的相對(duì)狀態(tài)、結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，引起熒光基團(tuán)與核酸或者熒光基團(tuán)與猝滅基團(tuán)間距離、狀態(tài)的變化，再導(dǎo)致熒光信號(hào)的變化，通過(guò)檢測(cè)這種熒光信號(hào)的變化定量檢測(cè)靶標(biāo)物質(zhì)，該類熒光定量檢測(cè)技術(shù)包括猝滅型雙探針介導(dǎo)型、熒光共振能量轉(zhuǎn)移型雙探針介導(dǎo)型等典型類型。

5.1 猝滅型雙探針介導(dǎo)的熒光定量檢測(cè)技術(shù)

猝滅型雙探針（Binary probe）介導(dǎo)的熒光定量檢測(cè)技術(shù)含有兩條單標(biāo)記探針，基于熒光猝滅原理，兩條探針設(shè)計(jì)時(shí)可以在特定結(jié)合位點(diǎn)與靶序列互補(bǔ)配對(duì)或與靶序列進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，當(dāng)靶信號(hào)存在時(shí)，兩探針?biāo)鶚?biāo)記的熒光信號(hào)相關(guān)物質(zhì)可以發(fā)生熒光產(chǎn)生，熒光猝滅，熒光波長(zhǎng)改變等熒光信號(hào)的變化，達(dá)到檢測(cè)目的。Heller 等［43］設(shè)計(jì)了一種雙探針介導(dǎo)的熒光定量檢測(cè)技術(shù)，他們利用兩條分別在3′端和5′端標(biāo)記熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)的可與靶序列互補(bǔ)配對(duì)的探針，當(dāng)其與擴(kuò)增后的靶序列結(jié)合時(shí)，兩段探針上的熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)足夠靠近，發(fā)生熒光猝滅，產(chǎn)生熒光信號(hào)。該探針在10個(gè)堿基至10 000個(gè)堿基的區(qū)間都可以實(shí)現(xiàn)結(jié)合，當(dāng)堿基數(shù)少于10個(gè)時(shí)，探針結(jié)合不穩(wěn)定，在低于20℃時(shí)會(huì)發(fā)生解離，當(dāng)堿基數(shù)大于10 000個(gè)時(shí)，結(jié)合過(guò)程時(shí)間過(guò)長(zhǎng)（圖2-G）。

5.2 熒光共振能量轉(zhuǎn)移型雙探針介導(dǎo)的熒光定量檢測(cè)技術(shù)

熒光共振能量轉(zhuǎn)移型雙探針介導(dǎo)的熒光定量檢測(cè)技術(shù)基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理，兩條探針設(shè)計(jì)時(shí)一條上邊進(jìn)行能量供體標(biāo)記，一條進(jìn)行能量受體標(biāo)記，可以在特定結(jié)合位點(diǎn)與靶序列互補(bǔ)配對(duì)或與靶序列進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，檢測(cè)機(jī)理與上述猝滅型相似。在理想的雙探針檢測(cè)中，供體的激發(fā)光僅僅可以在靶標(biāo)物質(zhì)不存在時(shí)候激發(fā)供體發(fā)熒光，在靶標(biāo)物質(zhì)存在時(shí)，供體不發(fā)熒光僅受體發(fā)熒光，但也由于激發(fā)光的直接激發(fā)，使得該系統(tǒng)熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率降低了信號(hào)/背景熒光比例，而這一問(wèn)題被由Marti等［44］報(bào)道的三熒光基團(tuán)探針系統(tǒng)有效解決，這一系統(tǒng)基于FAM-TAMRA-Cy5熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理對(duì)mRNA進(jìn)行檢測(cè)，這3種熒光物質(zhì)的發(fā)射檢測(cè)波長(zhǎng)分別為518 nm、581 nm和667 nm，該系統(tǒng)中一條探針標(biāo)記著被4個(gè)堿基對(duì)隔開(kāi)的FAM和TAMRA基團(tuán)，第二條被 Cy5所標(biāo)記，在靶標(biāo)DNA存在時(shí)，F(xiàn)AM能且僅能與TAMRA發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，當(dāng)探針與靶標(biāo)DNA結(jié)合時(shí)，TAMRA可與Cy5發(fā)生有效的熒光共振能量轉(zhuǎn)移，結(jié)果導(dǎo)致產(chǎn)生Cy5的熒光產(chǎn)生以及TAMRA熒光的減少，這種原理可以有效地提高信號(hào)/背景熒光比值（圖2-H）。

6 總結(jié)與展望

功能核酸熒光標(biāo)記型定量統(tǒng)一化檢測(cè)技術(shù)是一種具有高靈敏度，高特異性，甚至具有實(shí)時(shí)特性的分子檢測(cè)技術(shù)，目前在食品、臨床、環(huán)境多種檢測(cè)檢測(cè)領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用意義。但是，現(xiàn)階段仍存在一些局限性問(wèn)題，如在熒光物質(zhì)標(biāo)記方面，部分標(biāo)記型熒光物質(zhì)的標(biāo)記技術(shù)僅局限在特定堿基上，無(wú)法進(jìn)行多種堿基的檢測(cè)與標(biāo)記；有一部分具有優(yōu)良發(fā)光、猝滅熒光性質(zhì)的熒光物質(zhì)在功能核酸上的標(biāo)記技術(shù)不夠成熟，仍停留在實(shí)驗(yàn)室研究，未進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化階段。在標(biāo)記型熒光核酸傳感策略的設(shè)計(jì)方面，部分傳感策略對(duì)熒光物質(zhì)和核酸結(jié)構(gòu)變化的要求較為嚴(yán)格，只能實(shí)現(xiàn)在特定環(huán)境中對(duì)特定物質(zhì)的檢測(cè)，無(wú)法實(shí)現(xiàn)通用型檢測(cè)；傳感性能還有待優(yōu)化和完善，如熒光背景值過(guò)高、重復(fù)性不夠強(qiáng)、檢測(cè)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)等問(wèn)題。因此，需要針對(duì)熒光物質(zhì)、熒光傳感思路、熒光性能優(yōu)化等方面進(jìn)一步探索和思考，如通過(guò)對(duì)相關(guān)物質(zhì)發(fā)光機(jī)制、結(jié)構(gòu)特性等方面的探究，開(kāi)發(fā)、合成性能更佳的熒光物質(zhì)。同時(shí)，結(jié)合物質(zhì)發(fā)光特點(diǎn)更巧妙地設(shè)計(jì)在標(biāo)記型熒光傳感系統(tǒng)中，并優(yōu)化熒光物質(zhì)與功能核酸的標(biāo)記方式，使其結(jié)合程度更符合我們實(shí)驗(yàn)的要求；針對(duì)功能核酸標(biāo)記型熒光傳感設(shè)計(jì)時(shí)，可以考慮檢測(cè)靶標(biāo)物質(zhì)的通用性，將原來(lái)一種熒光傳感策略設(shè)計(jì)成一類或多類的通用型傳感策略。另外，開(kāi)發(fā)更高靈敏度，重復(fù)性更好的高通量實(shí)時(shí)傳感技術(shù)也是功能核酸熒光標(biāo)記型定量統(tǒng)一化檢測(cè)技術(shù)的重要研究方向。

圖2 熒光標(biāo)記型功能核酸介導(dǎo)的熒光定量檢測(cè)技術(shù)原理圖