集賢，張平*，朱志強，李志文，商佳胤，魏雅純

（1. 國家農(nóng)產(chǎn)品保鮮工程技術(shù)研究中心（天津）/天津市林業(yè)果樹研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮重點實驗室，天津 300384；2. 天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津 300384；3. 天津市設(shè)施農(nóng)業(yè)研究所，天津 301700）

葡萄品種按用途可分為鮮食、釀酒、制干、制汁等加工品種，中國是世界上葡萄較早栽培地之一。目前，中國栽培較多的鮮食品種有：‘巨峰’‘紅地球’‘玫瑰香’‘無核白’‘夏黑’等。葡萄不僅味美可口，而且營養(yǎng)價值很高。葡萄中的多種果酸有助于消化，適當(dāng)多吃些葡萄，能健脾和胃。

近些年，隨著市場經(jīng)濟(jì)的逐漸加快，對于葡萄的需求量也越來越大，市場供應(yīng)期相應(yīng)延長，因此對鮮食葡萄的貯藏保鮮技術(shù)提出了更高的要求。葡萄灰霉病，病原菌為灰葡萄孢，寄生范圍廣泛，腐生能力強，是目前葡萄采后貯藏運輸過程中主要病害之一。因為該菌在低溫條件（-0.5 ℃）仍能生長繁殖，因此充分了解不同品種采后對灰霉病的抗病性以及對果實的侵染規(guī)律，可以有效地控制采后病害的發(fā)生，為葡萄采后貯運保鮮提供理論基礎(chǔ)。

在葡萄采后運輸貯藏過程中，環(huán)境因子對生物的生長影響較大[1-2]，溫度是影響果品質(zhì)量最重要的因素之一，能夠直接影響果蔬的生理活性。溫控技術(shù)應(yīng)用廣泛且歷時已久，早期的窖藏、現(xiàn)代的冷庫貯藏等都是采用控制貯藏溫度的方法來延長果蔬貯藏期的。而隨著科學(xué)技術(shù)飛速發(fā)展，貯藏保鮮技術(shù)也在不斷更新，如今溫控技術(shù)在果蔬貯藏調(diào)控方面的應(yīng)用已非常成熟。近年來，關(guān)于溫度的貯藏技術(shù)包括低溫貯藏技術(shù)[3]、變溫貯藏技術(shù)[4]及冰溫貯藏技術(shù)[5]已廣泛用于果蔬貯運活動中。

本試驗采用有傷接種和無傷接種兩種方式，系統(tǒng)研究不同貯藏溫度對3個葡萄品種接種菌落直徑和發(fā)病率的影響，充分了解溫度對不同品種葡萄果實采后灰霉病的發(fā)病規(guī)律，了解不同葡萄品種對采后灰霉病的抗病性差異，為有效指導(dǎo)采后貯藏生產(chǎn)實踐和保鮮技術(shù)理論充分發(fā)揮實際作用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試葡萄：葡萄品種選擇‘玫瑰香’‘巨峰’和‘紅地球’，2015年9月分別購于天津市漢沽茶淀鎮(zhèn)、河北石家莊晉州市葡萄園、河北張家口市。

儀器：高壓滅菌鍋、紫外-可見分光光度計、高速冷凍離心機、恒溫培養(yǎng)箱、水浴鍋、塑料密封盒等。

1.2 試驗方法

1.2.1 灰霉菌的分離和提純

參照方中達(dá)[6]法，將發(fā)病葡萄表面菌絲在超凈工作臺上接入到PDA培養(yǎng)基中，放入恒溫培養(yǎng)箱不斷分離純化培養(yǎng)，直至在顯微鏡下觀察到提純的灰霉菌。

1.2.2 不同溫度下灰霉病菌對葡萄果實致病性的影響

（1）有傷接種。在超凈工作臺中，將分離純化后的灰霉菌PDA平板用燒熱的打孔器打滿3 mm的菌餅備用。選取大小整齊、無損傷的帶柄葡萄果粒，將實心桿燒熱刺傷果粒（直徑3 mm，深度5 mm），滅菌濾紙吸干溢出果汁，并接入直徑3 mm的菌餅。每果粒接種一個菌碟，每種溫度接種處理20粒左右（以占滿密封盒為準(zhǔn)），放入墊有無菌紗布的滅菌密封盒中。設(shè)置3個重復(fù)，于0 ℃、10 ℃、25 ℃下貯藏。從第2天開始，每天觀察發(fā)病情況，用游標(biāo)卡尺測量菌餅直徑并記錄，連續(xù)觀察7 d。

（2）無傷接種。在超凈工作臺中，將分離純化后的灰霉菌PDA培養(yǎng)基用燒熱的打孔器打10個10 mm的菌餅，放入滅菌的錐形瓶中，加入200 mL無菌水，震蕩1 h制成孢子懸浮液。選取大小整齊、無損傷的帶柄葡萄果粒浸入孢子懸浮液中，取出后自然晾干。每種溫度接種處理20粒左右（以占滿密封盒為準(zhǔn)），放入墊有無菌紗布的滅菌密封盒中。設(shè)置3個重復(fù)，于0 ℃、10 ℃、25 ℃下貯藏。從第2天開始，每天觀察發(fā)病情況，記錄連續(xù)拍照觀察7 d。隔幾天用液氮凍樣一次，共3次。葡萄果粒出現(xiàn)凹陷、長出灰霉菌計為發(fā)病果粒。計算發(fā)病葡萄果粒所占每盒總個數(shù)的百分?jǐn)?shù)含量，即發(fā)病率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同貯溫對有傷接種果實病斑直徑的影響

由圖1所示，從菌落生長趨勢來看，3個品種有傷接種變化趨勢類似，10 ℃和25 ℃貯藏條件下，隨著貯藏期的延長，果實上菌落直徑均呈現(xiàn)增加的趨勢；而0 ℃貯藏條件下，菌落的生長完全受到抑制。從菌落直徑的比較來看，0 ℃貯藏條件下，培養(yǎng)至7 d，由于菌落生長完全受到低溫的抑制，菌落直徑生長量為0，極顯著（P＜0.01）低于其余兩個溫度處理；10 ℃貯藏條件下，菌落直徑均極顯著（P＜0.01）小于25 ℃溫度處理。

圖1的分析結(jié)果可以明顯得出，隨著貯藏溫度的降低，有傷接種于各個品種果實上的灰霉菌生長均會受到不同程度的抑制，當(dāng)貯藏溫度降至0 ℃時，7 d內(nèi)3個品種果實上接種的灰霉菌均停止生長。從不同品種灰霉菌對溫度變化的耐受性來看，當(dāng)貯溫從25 ℃降至10 ℃，‘玫瑰香’接種的灰霉菌菌落直徑變化相對較小，因此其上接種灰霉菌對溫度變化的耐受性更強，說明‘玫瑰香’葡萄品種更易感病。

圖1 不同貯溫對有傷接種果實病斑直徑的影響Table 1 The effect of disease spot diameter of damage inoculation on fruit in different storage temperature

2.2 不同貯溫對無傷接種果實灰霉病發(fā)病率的影響

由圖2所示，從菌落生長趨勢來看，隨著貯藏期的延長，25 ℃貯藏條件下的發(fā)病率總體上呈先驟然增加后緩慢增加的趨勢；10 ℃貯藏條件下，發(fā)病率除‘玫瑰香’葡萄與25 ℃的發(fā)病率相差不大外，總體呈逐漸增加的趨勢；而0 ℃貯藏條件下，菌落的生長完全受到抑制。從發(fā)病率上來看，0 ℃貯藏條件下，培養(yǎng)至7 d，其發(fā)病率為0，極顯著（P＜0.01）低于其余兩個溫度處理；10 ℃貯藏條件下，‘玫瑰香’在培養(yǎng)1～3 d時菌落直徑接近25 ℃處理，在其余的貯藏時間內(nèi)，菌落直徑均小于25 ℃溫度處理；‘巨峰’僅在培養(yǎng)第1天、第2天和第6天時菌落直徑接近于25 ℃處理，而‘紅地球’在第4天時菌落直徑接近于25 ℃處理，在其余的貯藏時間內(nèi)，菌落直徑均顯著（P＜0.05）小于10 ℃處理。

圖2 不同貯溫對無傷接種果實灰霉病發(fā)病率的影響Table 2 The effect of Botrytis cinerea incidence by non-damage inoculation in different storage temperature on fruit

圖2的分析結(jié)果得出，隨著貯藏溫度的降低，無傷接種的‘玫瑰香’‘紅地球’果實上的灰霉菌生長均受到不同程度的抑制?！倒逑恪汀薹濉?5 ℃下發(fā)病率低于‘紅地球’，但‘紅地球’葡萄在10 ℃下發(fā)病率最低。當(dāng)貯藏溫度降至0 ℃時，7 d內(nèi)3個品種葡萄果實上接種的灰霉菌均停止生長。

2.3 不同貯溫對自然發(fā)病條件下葡萄灰霉病發(fā)病率的影響

自然狀態(tài)下，不同貯溫對采后灰霉病發(fā)病率的影響如圖3所示。從生長趨勢來看，隨著貯藏期的延長，25 ℃貯藏條件下，灰霉病發(fā)病率總體上呈增加的趨勢，而‘玫瑰香’葡萄發(fā)病率增加的最快，‘紅地球’葡萄增加的最慢；10 ℃貯藏條件下，發(fā)病率總體呈逐漸增加的趨勢，但‘玫瑰香’后期增加迅速；而0 ℃貯藏條件下，菌落的生長完全受到抑制。從發(fā)病率上來看，0 ℃貯藏條件下，培養(yǎng)至7 d，由于菌落生長完全受到低溫的抑制，其發(fā)病率幾乎為0，極顯著（P＜0.01）低于其余兩個溫度處理；10 ℃貯藏條件下，發(fā)病率均顯著（P＜0.05）小于25 ℃溫度處理。

圖3的分析結(jié)果可以得出，隨著貯藏溫度的降低，無傷接種于‘玫瑰香’‘巨峰’‘紅地球’果實上的灰霉菌生長均會受到不同程度的抑制。模擬自然狀態(tài)下生長的灰霉菌，25 ℃時‘玫瑰香’的發(fā)病率最高，‘巨峰’在25 ℃和10 ℃下發(fā)病率相近，第5天后增長緩慢。在0 ℃下，3個葡萄品種發(fā)病率均為零。

圖3 不同貯溫對自然條件下葡萄灰霉病發(fā)病率的影響Table 3 Effects of Botrytis cinerea incidence on under natural conditions in different storage temperatures

3 討論與結(jié)論

有傷接種模擬在運輸過程中有擠壓裂果的情況下灰霉病菌對果實的侵染狀況。結(jié)果表明，有傷接種灰霉病菌顯著增長，無傷接種灰霉菌的增長高于自然狀態(tài)下發(fā)病率。在運輸中，應(yīng)采取低溫貯藏的方法，并且做好防止裂果的工作，可以在一定程度上抑制灰霉菌的生長。

貯藏溫度是影響灰霉菌生長繁殖的重要因子之一[7]，本試驗研究得出以下結(jié)論：‘玫瑰香’‘巨峰’‘紅地球’葡萄在0 ℃的兩種接種方法下，觀察期內(nèi)并未發(fā)病，而在10 ℃和25 ℃下灰霉菌有明顯的生長繁殖現(xiàn)象，菌斑直徑顯著增大?？梢姷蜏赜行б种苹颐共〉陌l(fā)生與生長。本研究結(jié)果也印證了葡萄最適貯藏溫度普遍認(rèn)為是0～-1 ℃[8-10]的結(jié)論，同時也與前期本課題組低溫能夠很好地抑制灰霉病菌孢子的研究相呼應(yīng)[11]。低溫條件下灰霉病對果實的侵染率低，與低溫可以降低果實的呼吸速率和抑制酚類物質(zhì)的增加有關(guān)[12]，同時也與低溫條件能顯著減少葡萄果肉和果皮抗氧化組分含量的下降，可以維持果實較高的自由基清除能力有關(guān)[13]。