梁爽

骨肉瘤多發(fā)生于青少年，其特點表現(xiàn)為早期轉(zhuǎn)移，且最易出現(xiàn)肺部轉(zhuǎn)移，一旦檢測到轉(zhuǎn)移病灶，則嚴重威脅患者生命健康[1]。臨床主要采用截肢手術(shù)治療，但手術(shù)實施不僅會影響肢體功能，還會影響患者心理健康。為改善患者預后，臨床認為治療關(guān)鍵在于早期診斷鑒別骨肉瘤，為靶向治療提供指導依據(jù)。既往研究有提出，低氧誘導因子-1α(HIF-1α)和抑癌基因(PTEN)發(fā)生與某些惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但關(guān)于其與骨肉瘤之間的相關(guān)性，臨床研究較少[2]。本次研究表明，應用免疫組化法檢測骨肉瘤中HIF-1α和PTEN，重點探究骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中HIF-1α、PTEN水平以及相關(guān)性，為臨床診治提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院骨科從2017年1月到2018年2月接受骨肉瘤手術(shù)切除的骨肉瘤標本25例，且病理證實，術(shù)前患者均未經(jīng)放化療治療。25例患者的臨床資料，男18例，女7例，年齡8～60歲，平均年齡(34.0±2.5)歲，病理分級：低分化8例，中分化9例，高分化8例；組織學分型經(jīng)Dahlin分型：軟骨母細胞型7例，纖維母細胞型8例，骨母細胞型8例，其他類型2例，根據(jù)Enneking分期：Ⅰ期(低度惡性)6例，ⅡA期(高度惡性)7例，ⅡB期(高度惡性)5例，Ⅲ期(任何分級)7例。另選取同期病理科收集的軟骨瘤標本20例對照研究，男12例，女8例，年齡10～72歲，平均年齡(33.8±2.2)歲。收集標本統(tǒng)一進行分割保存，在組織固定前將其從液氮中取出，之后放入到調(diào)配為4%多聚甲醛中，固定處理24～48 h，固定處理后從多聚甲醛中取出后，經(jīng)PBS緩沖液漂洗，目的在清除固定中應用多聚甲醛溶液，避免影響后期研究結(jié)果。之后將標本包埋處理，連續(xù)做3 μm厚度切片。

1.2 方法 選擇的試劑為鼠抗人PTEN單克隆抗體、鼠抗人HIF-1α單克隆抗體、SP試劑盒、DAB顯色試劑盒。應用免疫組化SP法，具體內(nèi)容為：首先烤片，組織切片放于68℃恒溫箱中進行烘烤，持續(xù)時間20～30 min；第二步，脫蠟，將切片放于二甲苯中，浸泡2次，每次浸泡時間10 min；第三步，阻斷，針對內(nèi)源性過氧化物酶實施滅活，3%H2O237 ℃孵育10 min，經(jīng)PBS沖洗3×5 min；第四步，抗原修復，放入到0.01M枸櫞酸緩沖液(PH 6.0)中，加熱到95℃，持續(xù)15～20 min，自然冷卻至少20 min，之后經(jīng)冷水對缸子進行沖洗，快速冷卻到室溫，經(jīng)PBS沖洗3×5 min；第五步，應用正常羊血清工作液進行封閉，保持溫度37℃10 min；第六步：加入抗4℃冰箱中經(jīng)孵育過夜，PBS沖洗3×5 min，用PBS緩沖液取代一抗做陰性為對照組，滴入生物素作為二抗，在37℃環(huán)境下孵育30 min，PBS沖洗3×5 min；第七步：加入辣根過氧化物酶做標記，在37℃環(huán)境下孵育30 min，PBS沖洗3×5 min；第八步：經(jīng)DAB/H2O2反應做染色處理，之后經(jīng)自來水沖洗。蘇木素進行復染，常規(guī)脫水處理后，保持干燥狀態(tài)下，進行封片處理。整個實驗操作過程中，嚴格遵照說明書操作進行。將已知陽性切片為對照組，PBS代替一抗為陰性對照組。

1.3 觀察評價 染色試驗結(jié)果為棕黃色，則判定為陽性。經(jīng)顯微攝像計算機進行系統(tǒng)分析，每個切片隨機取5個視野(400倍)，檢查結(jié)果無陽性細胞，則判定為陰性(-)，陽性細胞不足50%，則判定為陽性(+)，若陽性細胞數(shù)量超過5%，選擇判定為強陽性(++)。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 20.0軟件處理，實驗數(shù)據(jù)計數(shù)資料經(jīng)卡方檢驗，并對HIF-1α、PTEN表達做相關(guān)性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HIF-1α、PTEN在骨肉瘤與骨軟骨瘤中的表達(表1) 組織中HIF-1α陽性染色定位于腫瘤細胞核中，顯示為棕褐色顆粒，兩組HIF-1α陽性表達差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。PTEN陽性染色定位于腫瘤細胞漿中，顯示為棕黃色顆粒，PTEN陽性表達率組間比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，這表明HIF-1α、PTEN表達與骨肉瘤密切相關(guān)，HIF-1α在骨肉瘤中的表達扮演者癌基因角色，而PTEN則扮演著抑癌基因角色。

表1 HIF-1α、PTEN在骨肉瘤與骨軟骨瘤中的表達(n)

2.2 骨肉瘤、軟骨肉瘤中HIF-1α、PTEN表達相關(guān)性 骨肉瘤中HIF-1α、PTEN表達相關(guān)性分析，PTEN表達越高，則HIF-1α表達相應下降，反之，PTEN陽性表達水平低，則HIF-1α相對較高，HIF-1α水平隨PTEN表達下降而呈現(xiàn)逐步升高的趨勢，檢驗分析表明HIF-1α與PTEN間為負相關(guān)(表2)。軟骨肉瘤中HIF-1α、PTEN表達相關(guān)性分析，PTEN表達與HIF-1α表達呈正相關(guān)性(表3)。

表2 骨肉瘤中HIF-1α、PTEN表達相關(guān)性(n)

表3 軟骨肉瘤中HIF-1α、PTEN表達相關(guān)性(n)

3 討論

骨肉瘤為一種常見非血液系統(tǒng)的原發(fā)性骨腫瘤疾病，多發(fā)生于四肢長骨干骺端，青少年比較多發(fā)常見。該疾病病情惡化發(fā)展快，具有較高的病灶轉(zhuǎn)移率，一旦發(fā)生病灶轉(zhuǎn)移，則大大降低患者的生存率，臨床多采用手術(shù)治療[3]。隨著醫(yī)療技術(shù)水平的進步，外科手術(shù)、放化療輔助等治療方法獲得長遠發(fā)展，保肢手術(shù)治療成為臨床治療骨肉瘤的主要方法，尤其是新輔助化療聯(lián)合保肢手術(shù)療效顯著，雖然可一定程度提高患者的生存率，但預后效果仍不理想[4-5]。

但當前臨床缺乏對該疾病發(fā)病機制的認知了解，無法進行早期診斷、鑒別分期，若能明確骨肉瘤分子標志物，便可為臨床診治提供指導依據(jù)，這是當前臨床重要的研究內(nèi)容。缺氧誘導因子HIF-1是在人類腫瘤與多種動物中發(fā)現(xiàn)的具有高表達的轉(zhuǎn)錄因子，是細胞缺氧時穩(wěn)定表達的蛋白質(zhì)[6]。該物質(zhì)為一種異源二聚體，包括α、β兩個亞單位。研究發(fā)現(xiàn)，人體多腫瘤組織HIF-1α具有較高的表達水平，尤其是缺氧腫瘤組織中表達水平較高，與預后水平相關(guān)[7]。惡性腫瘤疾病發(fā)生發(fā)展中，腫瘤生長速度明顯超過血管生長速度，會導致局部缺氧，誘發(fā)HIF-α表達[7-8]。HIF-α高表達激活下游設(shè)計腫瘤細胞增生、血管生成、糖代謝、腫瘤轉(zhuǎn)移等靶基因作用，提高紅細胞生成素，增強腫瘤細胞的氧運輸能力；提高糖酵解能力；促腫瘤細胞增生，通過上述作用機制可有效發(fā)揮改善腫瘤細胞供氧、供血，促腫瘤生長作用。本次研究表明，骨肉瘤中HIF-α表達率為52.0%，這表明該指標在骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。PTEN為當前第一個發(fā)現(xiàn)具有雙重特異性磷酸酶活性抑癌基因，具有促使磷酸化的蘇氨酸、絲氨酸、酪氨酸去磷酸化的作用，通過去磷酸化，而發(fā)揮有效的抑癌效果。本次研究表明，骨肉瘤組織中，PTEN陽性表達高于在骨軟骨瘤組織中，臨床可將PTEN基因表達下降作為疾病早期診斷、預后的重要分子指標[9-10]。而且研究分析HIF-α、PTEN的蛋白表達水平呈負相關(guān)，兩者在骨肉瘤組織中表達具有拮抗作用。

綜上所述，臨床可通過聯(lián)合檢測HIF-α、PTEN用于骨肉瘤早期診斷、預后評估，這對于抑制骨肉瘤病情惡化發(fā)展具有重要意義。