毛 菊，楊雯雯，陳 穩(wěn)，沈國(guó)棟，徐婷娟，程 民，胡世蓮

(中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，安徽省立醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，安徽省老年醫(yī)學(xué)研究所腫瘤分子實(shí)驗(yàn)室，腫瘤免疫與營(yíng)養(yǎng)治療安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230001)

在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,免疫系統(tǒng)起著至關(guān)重要的作用。EHRLICH[1]提出免疫監(jiān)視理論,認(rèn)為免疫系統(tǒng)的一項(xiàng)重要功能是從人體中檢測(cè)和消除腫瘤細(xì)胞。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、生活節(jié)奏的加快以及癌癥發(fā)病率的不斷攀升，我國(guó)上消化道腫瘤患者數(shù)量日益增長(zhǎng)，上消化道腫瘤患者常伴有免疫功能障礙，機(jī)體的免疫功能狀態(tài)影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及預(yù)后。檢測(cè)上消化道腫瘤患者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、NK細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞的比例，對(duì)患者的機(jī)體免疫功能監(jiān)測(cè)、臨床治療以及預(yù)后判斷具有重要的指導(dǎo)意義。鑒于此，筆者檢測(cè)102例上消化道腫瘤患者外周血中NK細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞的比例，探討上述細(xì)胞比例與患者臨床分期之間的關(guān)系。報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年6月至2017年4月中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院收治的上消化道惡性腫瘤患者102例，按腫瘤分期分為2組：對(duì)照組45例，均為Ⅱ—Ⅲ期患者，男33例、女12例，年齡42～77歲、平均(63±1)歲，病理類(lèi)型：食管癌11例、胃癌34例；觀察組57例，均為Ⅳ期患者，男50例、女7例，年齡46～82歲、平均(63±1)歲，病理類(lèi)型：食管癌24例、胃癌33例。2組患者的性別、年齡等一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 入選標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：1)所有病例均經(jīng)病理學(xué)確診符合食管癌或胃癌病理學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)(參照2010版消化系統(tǒng)腫瘤WHO分類(lèi))[2-3]；2)未服用激素類(lèi)藥物或接受免疫抑制劑治療；3)臨床分期標(biāo)準(zhǔn)：食管癌、胃癌臨床分期依據(jù)2017年第八版AJCC，TNM分期中T、N、M的定義分別為原發(fā)腫瘤T、區(qū)域淋巴結(jié)N、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移M，臨床分期包括Ⅰ—Ⅳ期[2-3]。排除標(biāo)準(zhǔn)：1)未經(jīng)明確診斷的食管癌或胃癌；2)明確診斷為食管癌或胃癌但未做全NK、T、Treg細(xì)胞檢測(cè)者。

1.3 試劑與儀器

T細(xì)胞亞群檢測(cè)試劑盒、NK檢測(cè)試劑盒、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞檢測(cè)試劑(包括CD4-FITC、CD25-PE、CD127-Percp-cy5.5、CD45-APC)，上述試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Beckton Dickinson公司；使用BD FACS Calibur流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckton Dickinson公司)及Cellquest軟件進(jìn)行細(xì)胞檢測(cè)與分析。

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞檢測(cè)

取50 μL抗凝外周血加入流式管，再向流式管中依次加入CD4-FITC、CD25-PE、CD127-Percp-cy5.5和CD45-APC抗體，避光孵育15 min；加入500 μL BD溶血素混勻，避光10 min，2000 r·min-1，5 min離心，棄上清；加入1 mL PBS溶液重懸，2000 r·min-1，5 min離心，棄上清；使用300 μL PBS溶液重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)。

1.4.2 NK細(xì)胞檢測(cè)

取50 μL抗凝外周血加入流式管，再向流式管中加入20 μL CD3-FITC/CD16+CD56-PE抗體，避光孵育15 min；加入500 μL BD溶血素混勻，避光10 min，2000 r·min-1，5 min離心，棄上清；加入1 mL PBS溶液重懸，2000 r·min-1，5 min離心，棄上清；使用300 μL PBS溶液重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)。

1.4.3 T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)

取50 μL抗凝外周血加入流式管，再向流式管中加入20 μL CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PERC P/CD4-APC抗體，避光孵育15 min；加入500 μLBD溶血素混勻，避光10 min，2000 r·min-1，5 min離心，棄上清；加入1 mL PBS溶液重懸，2000 r·min-1，5 min離心，棄上清；使用300 μL PBS溶液重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

與對(duì)照組相比，觀察組外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，外周血CD4+T細(xì)胞比例明顯降低，外周血CD8+T細(xì)胞比例、NK細(xì)胞比例明顯增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 2組NK細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞亞群及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例比較

3 討論

腫瘤的發(fā)生與內(nèi)外環(huán)境各種因素的綜合作用相關(guān)，正常細(xì)胞受到有害刺激，惡性突變成癌細(xì)胞，繼而持續(xù)擴(kuò)增形成腫瘤組織[4]。惡性腫瘤患者常伴有機(jī)體免疫功能的異常，作為細(xì)胞免疫最重要的T淋巴細(xì)胞通過(guò)功能各異的T淋巴細(xì)胞亞群來(lái)發(fā)揮免疫調(diào)控作用[5]。在上消化道腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，機(jī)體的免疫功能也發(fā)生了顯著改變，主要表現(xiàn)為免疫防御和免疫監(jiān)視功能的降低。隨著對(duì)腫瘤免疫機(jī)制的不斷探索和腫瘤免疫營(yíng)養(yǎng)治療的應(yīng)用，較多的細(xì)胞免疫檢測(cè)指標(biāo)用于判斷腫瘤患者的疾病狀態(tài)、治療效果及預(yù)后，其中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、NK細(xì)胞、T細(xì)胞亞群的測(cè)定較為常用。

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是具有一定免疫抑制功能的T細(xì)胞亞群，即是一群CD4+CD25+CD127low T細(xì)胞。NK細(xì)胞(CD3-CD16+/CD56+)是非抗原依賴性免疫效應(yīng)細(xì)胞，可以不經(jīng)致敏直接殺傷腫瘤細(xì)胞[6]，具有抗腫瘤免疫，與細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞在機(jī)體免疫防御方面發(fā)揮著重要的作用[7-8]。研究表明在胃癌中重建NK細(xì)胞功能可以很好地預(yù)防腫瘤免疫逃逸，是機(jī)體免疫監(jiān)視系統(tǒng)的重要組成部分，也是機(jī)體抗御感染和防止細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的重要免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞[9]。T細(xì)胞可分為T(mén)h(CD3+CD4+)和Ts(CD3+CD8+)細(xì)胞。若T細(xì)胞總數(shù)或CD4+/CD8+T細(xì)胞比值降低，即可視為免疫調(diào)節(jié)功能紊亂，易發(fā)生腫瘤或自身免疫病。已有研究顯示，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，NK細(xì)胞，T淋巴細(xì)胞亞群測(cè)定是反映腫瘤患者的機(jī)體免疫功能狀態(tài)常用指標(biāo)[10-11]。王祝榮等[13]選取226例宮頸癌患者和同期健康體檢者60例女性作為對(duì)照組,結(jié)果表明T淋巴細(xì)胞亞群與NK細(xì)胞水平可反映宮頸癌患者的細(xì)胞免疫功能,且宮頸癌臨床分期越晚,細(xì)胞免疫功能越低。王勇[14]認(rèn)為測(cè)定惡性腫瘤患者外周血中T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)目變化對(duì)臨床確定治療方案及療效觀察具有一定意義。腫瘤微環(huán)境中的T淋巴細(xì)胞具有至關(guān)重要的免疫監(jiān)視作用[15]。鐘銳等[16]認(rèn)為晚期胃癌患者外周血中Treg(CD4+CD25+CD127low)細(xì)胞的表達(dá)水平明顯高于健康體檢者，且化療后降低，有助于判斷化療療效。趙強(qiáng)等[17]認(rèn)為食管癌外周血Treg(CD4+CD25+CD127low)細(xì)胞比例能較敏感、特異地反映其細(xì)胞免疫功能狀態(tài)，有可能成為反映食管癌免疫狀態(tài)及疾病進(jìn)展的外周血標(biāo)志物。

本研究中Ⅳ期上消化道腫瘤患者Treg細(xì)胞的表達(dá)水平與Ⅱ、Ⅲ期相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可能與本研究中病例數(shù)不夠以及將胃癌、食管癌整合在一起分析的因素相關(guān)。本研究結(jié)果顯示上消化道腫瘤臨床Ⅳ期患者CD4+T細(xì)胞的比例較Ⅱ、Ⅲ期患者明顯降低，CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞比例較Ⅱ、Ⅲ期患者明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明不同臨床分期的腫瘤患者外周血免疫狀態(tài)存在差異，臨床Ⅳ期患者的免疫功能比Ⅱ、Ⅲ期患者更差。當(dāng)上消化道腫瘤患者的CD4+T細(xì)胞的比例明顯降低，CD8+T細(xì)胞比例明顯升高且調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例升高時(shí)表明患者目前的免疫力較差，在治療中需要考慮改善患者免疫力如采用腫瘤免疫營(yíng)養(yǎng)支持治療的方法。通過(guò)檢測(cè)上消化道腫瘤患者外周血NK、T、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可以較早評(píng)估患者免疫狀況，對(duì)臨床診療活動(dòng)具有一定的指導(dǎo)意義。綜上所述，檢測(cè)上消化道腫瘤患者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、NK細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞的比例，有助于發(fā)現(xiàn)上消化道腫瘤患者的免疫功能是否存在異常，進(jìn)而指導(dǎo)臨床醫(yī)生對(duì)上消化道腫瘤患者的病情判斷、治療方案的制定及預(yù)后評(píng)估。