頡鴻笙， 曹 源， 樂(lè)昌昊， 李嘉琪， 李博文， 況曉東， 肖建生

(南昌大學(xué) 1第一附屬醫(yī)院普外科， 2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室， 3第二臨床醫(yī)學(xué)院， 4第一臨床醫(yī)學(xué)院， 江西 南昌 330006)

腎臟作為高灌注器官，對(duì)缺血及缺血再灌注均十分敏感[1]。研究發(fā)現(xiàn)，腎缺血再灌注損傷(ische-mia-reperfusion injury，IRI)與氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激密切相關(guān)[2-3]。近年來(lái)，核仁作為一個(gè)新的并且十分重要的細(xì)胞應(yīng)激中樞，在腫瘤及心血管、神經(jīng)系統(tǒng)等疾病中發(fā)揮重要作用[4-5]，但核仁應(yīng)激否參與了IRI這一過(guò)程以及如何發(fā)揮作用，還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。狹義上，核仁應(yīng)激指各種損害核糖體合成并使細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)的過(guò)程，故也稱為核糖體應(yīng)激[6-7]；目前被廣泛定義為各種誘導(dǎo)核仁結(jié)構(gòu)和功能改變的異常情況[8]。研究表明，核仁應(yīng)激與p53關(guān)系密切[9-10]，而IRI常通過(guò)p53而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11-12]。因此，我們分別檢測(cè)腎IRI的病理改變以及核仁應(yīng)激相關(guān)的RNA和蛋白表達(dá)，旨在證實(shí)腎IRI中核仁應(yīng)激的發(fā)生，并進(jìn)一步探究核仁應(yīng)激對(duì)腎皮質(zhì)再灌注細(xì)胞的影響。希望本文能從核仁的視角，為防治腎IRI提供新的策略。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

48只昆明系雄性健康小鼠, 體質(zhì)量(20±5)g，購(gòu)自南昌大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)為SYXK(贛)2010-0002。小鼠實(shí)驗(yàn)前10 h禁食，自由飲水。

2 腎臟IRI模型的建立

將48只小鼠按照腎缺血時(shí)間不同隨機(jī)分為缺血0 min(control)組、30 min、45 min和60 min 共4個(gè)組，每組12只。稱重后用10%水合氯醛溶液腹腔麻醉(4 mL/kg)，待角膜及痛覺(jué)反射消失，行俯臥位固定，腰背部腎區(qū)備皮消毒。分別于脊柱左右各0.5 cm、肋骨下緣0.5 cm處剪開(kāi)皮膚和肌層，進(jìn)入腹腔后間隙，游離腎周筋膜和脂肪組織，暴露腎門(mén)，用微創(chuàng)動(dòng)脈夾一次性阻斷腎動(dòng)脈(control組只分離出腎門(mén)處腎動(dòng)脈，并繼續(xù)維持腹腔開(kāi)放狀態(tài)60 min)，雙側(cè)腎動(dòng)脈夾閉的時(shí)間差小于30 s，可見(jiàn)雙腎在1 min內(nèi)顏色變黑。按照分組時(shí)間取下夾子后，雙腎立即由紫黑色“擴(kuò)散樣”恢復(fù)為鮮紅則造模成功。逐層縫合關(guān)腹，保持室溫28 ℃左右，恢復(fù)供食飲水。IRI組小鼠自取下雙側(cè)動(dòng)脈夾開(kāi)始計(jì)時(shí)(control組滿足腹腔開(kāi)放狀態(tài)60 min后開(kāi)始計(jì)時(shí))，24 h后取樣進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)，同組小鼠取樣時(shí)間差控制在5 min內(nèi)。

3 主要方法

3.1腎功能指標(biāo)的檢測(cè) 測(cè)量血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)和血清肌酐(serum creatinine，SCr)對(duì)IRI的腎組織進(jìn)行功能評(píng)估：取下動(dòng)脈夾24 h后收集小鼠眼球內(nèi)眥靜脈血于肝素化的EP管中抗凝，混勻后立即4 000 r/min離心10 min，取上清液于4 ℃冰箱保存，并在當(dāng)天分別利用肌氨酸氧化酶法和二乙酰肟法測(cè)定樣本中BUN和SCr濃度(試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所)，其中吸光度使用SHIMADZU公司UV-1800分光光度計(jì)測(cè)定3次，取平均值。

3.2腎系數(shù)的檢測(cè) 取眼球血后迅速引頸處死小鼠，經(jīng)背部依層剪開(kāi)、摘取雙腎，用生理鹽水沖洗后剝離包膜并稱重計(jì)算。腎系數(shù)=雙側(cè)腎重(mg)/體重(g)

3.3病理組織學(xué)檢測(cè) 左側(cè)裸腎稱重后用全自動(dòng)脫水機(jī)進(jìn)行常規(guī)固定、脫水、透明和包埋，制成厚約3 μm石蠟切片，再參考HE染色試劑盒(Solarbio)說(shuō)明進(jìn)行染色。封片后，每張切片在高倍鏡下隨機(jī)取24 個(gè)視野，參照Erdogan等[13]損傷評(píng)估，采用盲法做半定量分析：0分為無(wú)損傷；1分為輕微損傷(0～5%)；2分為輕度損傷(5%～25%)；3分為中度損傷(25%～75%)；4 分為重度損傷(75%～100%)。

3.4Western blot實(shí)驗(yàn) 取右側(cè)新鮮裸腎，將皮質(zhì)組織剪碎并置于RIPA和PMSF(Abcam)的蛋白裂解液中冰浴勻漿，經(jīng)12 000 r/min離心5 min后保存上清液。根據(jù)BCA蛋白濃度測(cè)定結(jié)果，用Loading Buffer按照每孔10 μL上樣量配平并加熱100 ℃，5 min變性。樣品經(jīng)常規(guī)SDS-PAGE、轉(zhuǎn)PVDF膜和5%脫脂奶粉封閉后I抗4 ℃孵育過(guò)夜。次日行TBST洗膜、II抗孵育以及ECL顯影液凝膠成像。其中內(nèi)參照選用GAPDH,目的蛋白為p53(所有抗體均購(gòu)自SAB)。

3.5RT-qPCR實(shí)驗(yàn) 取材來(lái)自小鼠右側(cè)新鮮裸腎，將皮質(zhì)組織剪碎勻漿，采用TRIzol Reagent改良法提取總RNA。 使用EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix(Transgen)從總RNA合成第1鏈cDNA，并置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?20 μL RT-qPCR體系(Transgen)包括：逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，2×Tip Green qPCR SuperMix 10 μL，ddH2O 7.7 μL。每個(gè)樣品做3個(gè)復(fù)孔，經(jīng)StepOnePlus Real-Time PCR儀特異性擴(kuò)增目的基因的cDNA，反應(yīng)條件為：94 ℃ 30 s;94 ℃ 5 s, 60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。所得結(jié)果使用2-ΔΔCt法分析數(shù)據(jù)，引物序列見(jiàn)表1。

表1 RT-qPCR引物序列

F: forward; R: reverse.

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 20.0錄入與分析，所得結(jié)果均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組間數(shù)據(jù)比較采用方差齊性檢驗(yàn)和單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 術(shù)后存活率的比較

48只小鼠術(shù)后存活43只，存活率為89.6%，其中control組全部存活，IRI組中因手術(shù)操作不當(dāng)死亡者4只，無(wú)明顯原因死亡者1只，均于關(guān)腹前失去生命體征。

2 腎IRI相關(guān)指標(biāo)的比較

小鼠腎臟急性IRI后，腎組織結(jié)構(gòu)和功能均有明顯改變。進(jìn)入腹膜后間隙，可見(jiàn)腎包膜緊張呈腫脹樣，表面時(shí)有散在分布的出血點(diǎn)。與control組相比，各IRI組腎系數(shù)升高(P<0.01)，且60 min組較其余IRI組明顯增高(P<0.01)，見(jiàn)表2。光鏡下，HE染色顯示control組腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)完整清晰，未見(jiàn)明顯異常；IRI組病理改變顯著，腎小球明顯充血；腎小管上皮細(xì)胞水腫呈空泡樣變，部分壞死脫落造成管腔堵塞、擴(kuò)張，腔內(nèi)可見(jiàn)明顯的蛋白管型和顆粒管型；腎間質(zhì)顯著灶性炎細(xì)胞浸潤(rùn)伴出血，見(jiàn)圖1。與control組相比，各IRI組Erdogan評(píng)分增加(P<0.01)，見(jiàn)表2；損傷范圍與缺血時(shí)間呈正相關(guān)(r=0.83,P<0.01)。同時(shí)，IRI組BUN和SCr均高于control組(P<0.01)，并與缺血時(shí)間呈正相關(guān)(r=0.85,P<0.01)。與30 min組比較，45 min組和60 min組BUN和SCr顯著增高(P<0.01)；與45 min組比較，60 min組SCr明顯增高(P<0.01)，見(jiàn)表2。上述結(jié)果顯示，小鼠急性腎IRI模型建立成功，腎組織結(jié)構(gòu)和功能損害與缺血時(shí)間存在相關(guān)性。

Figure 1.The pathological changes of renal cortex with different ischemic time (HE staining, ×200).

圖1 不同缺血時(shí)間對(duì)腎皮質(zhì)組織的病理影響

表2 小鼠腎不同缺血時(shí)間再灌注對(duì)腎系數(shù)、病理?yè)p傷評(píng)分、BUN和SCr的影響

Table 2.The changes of renal coefficient, Erdogan scores, BUN and SCr in the mice with different ischemic time (Mean±SD.n=8)

GroupRenal coefficientErdogan scoresBUN (mmol/L)SCr (μmol/L)Control12.61±2.510.38±0.5010.38±1.8139.71±5.0430 min15.82±1.68##2.88±0.99##16.65±5.13##137.80±17.49##45 min17.52±1.93##3.33±0.70##25.14±4.79##??248.04±28.12##??60 min20.98±1.91##??▲▲3.54±0.59##??30.90±6.10##??310.64±27.94##??▲▲

##P<0.01vscontrol group;**P<0.01vs30 min group;▲▲P<0.01vs45 min group.

3 腎IRI中核仁應(yīng)激作用的觀察

在腎IRI模型建立成功的基礎(chǔ)上，我們通過(guò)RT-qPCR和Western blot檢測(cè)了核仁應(yīng)激指標(biāo)。與control組相比，IRI各組45S pre-rRNA和18S rRNA均表達(dá)下調(diào)(P<0.01)，前者較后者更為顯著；各IRI組之間隨著缺血時(shí)間延長(zhǎng)，45S pre-rRNA和18S rRNA的表達(dá)降低(P<0.01)，見(jiàn)圖2A。此結(jié)果提示核糖體RNA含量下降系rDNA轉(zhuǎn)錄受阻，IRI使核仁的核糖體生物合成功能紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞核仁應(yīng)激。同時(shí)，相較于control組，IRI各組p53蛋白含量顯著上升(P<0.05)，各IRI組間p53表達(dá)無(wú)顯著差異，見(jiàn)圖3。

Figure 2.Relative RNA expression detected by RT-qPCR. A: relative expression of rRNA in renal cortex with different ischemic time; B: relative expression of mRNA in renal cortex with different ischemic time. Mean±SD.n=8.##P<0.01vscontrol group;**P<0.01vs30 min group;▲▲P<0.01vs45 min group.

圖2 RT-qPCR 檢測(cè) RNA 的相對(duì)表達(dá)量

Figure 3.The protein expression of p53 detected by Western blot. Mean±SD.n=3.#P<0.05vscontrol group.

圖3 Western blot 檢測(cè) p53 的蛋白表達(dá)

4 腎IRI中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的比較

為了明確核仁應(yīng)激在小鼠急性腎IRI中發(fā)揮保護(hù)還是損傷效應(yīng)，我們利用RT-qPCR檢測(cè)了細(xì)胞凋亡的指標(biāo)。與control組相比，IRI各組Bax mRNA表達(dá)增加(P<0.01),Bcl2 mRNA表達(dá)下降(P<0.01)；與30 min組相比，45 min組的上述改變?nèi)跃哂酗@著差異(P<0.01)，見(jiàn)圖2B。上述結(jié)果中Bax/Bcl2比值增加，表明核仁應(yīng)激在腎IRI模型中誘導(dǎo)腎皮質(zhì)細(xì)胞凋亡。

討 論

核仁是一種位于細(xì)胞核內(nèi)的無(wú)膜亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，主要功能是合成核糖體并響應(yīng)胞內(nèi)多種應(yīng)激信號(hào)[14]。在真核細(xì)胞中，RNA聚合酶Ⅰ(RNA polymerase I, Pol I)和Ⅲ分別在核仁和核質(zhì)中完成rDNA的轉(zhuǎn)錄，形成45S pre-rRNA和5S rRNA。45S pre-rRNA又在多種轉(zhuǎn)錄因子的參與下加工形成18S、28S和5.8S的成熟rRNA，等待與核糖體蛋白(ribosomal protein, RP)裝配形成40S和60S核糖體亞基，故45S pre-rRNA及其裂解形成的下游rRNA含量共同反映Pol I的轉(zhuǎn)錄功能。在整個(gè)核糖體合成的過(guò)程中，大約有4 500種不同的蛋白參與其中[15]，所需的物質(zhì)和能量高達(dá)整個(gè)細(xì)胞的80%[16]，因此細(xì)胞必須對(duì)其進(jìn)行質(zhì)與量的嚴(yán)格監(jiān)管。大量研究表明[9-10]：核仁應(yīng)激時(shí)RP和多種轉(zhuǎn)錄因子不再進(jìn)行核糖體合成，而是將應(yīng)激信號(hào)傳遞給p53，從而誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯或凋亡。例如：RPL5和RPL11會(huì)在核質(zhì)中與鼠雙微體2同系物(murine double minute 2 homolog, Mdm2)的中心酸性域結(jié)合，解除Mdm2對(duì)p53的泛素化抑制[17-18]；核仁磷酸蛋白(nucleophosmin, NPM)也不再參與45S pre-rRNA的加工，而是因谷胱甘肽化失去與核仁內(nèi)rDNA/rRNA的錨定，從而移位到核質(zhì)結(jié)合Mdm2并激活p53[19]。在腎IRI模型中，抑制p53具有保護(hù)腎小管細(xì)胞的作用，提示再灌注細(xì)胞中p53與啟動(dòng)凋亡程序密切相關(guān)[11-12]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與control組相比，IRI組45S pre-rRNA和18S rRNA均表達(dá)下調(diào)，反映了Pol I轉(zhuǎn)錄功能受阻，核仁功能障礙。同時(shí)，Western blot也檢測(cè)到IRI組p53表達(dá)顯著上升，證實(shí)了核仁應(yīng)激的發(fā)生和信號(hào)的傳遞。最后，IRI組較control組Bax mRNA含量上調(diào)而B(niǎo)cl2 mRNA含量下降，說(shuō)明核仁應(yīng)激通過(guò)p53在腎IRI中發(fā)揮損傷效應(yīng)。除此之外，我們分別以Erdogan評(píng)分和BUN、SCr為衡量腎結(jié)構(gòu)和功能的指標(biāo)，證明了腎IRI程度與缺血時(shí)間之間存在顯著相關(guān)性。

深入思考腎IRI中核仁應(yīng)激發(fā)生的原因，我們認(rèn)為活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生是一個(gè)關(guān)鍵因素。當(dāng)創(chuàng)傷、休克或外科手術(shù)后氧合血流重新供應(yīng)缺氧組織并導(dǎo)致不可逆的損傷，就會(huì)發(fā)生缺血再灌注損傷[20-21]。腎髓質(zhì)和乳頭細(xì)胞通過(guò)無(wú)氧酵解產(chǎn)生三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)，所以對(duì)低氧環(huán)境并不敏感；然而，腎皮質(zhì)細(xì)胞需氧量極高，一旦腎血流中斷，線粒體難以維持氧化磷酸化，胞內(nèi)累積過(guò)量ROS[22-23]。在這種強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激狀態(tài)下，不僅rDNA存在極高的損傷風(fēng)險(xiǎn)，Pol I相關(guān)的轉(zhuǎn)錄起始因子IA(transcription initiation factor-IA, TIF-IA)也會(huì)發(fā)生磷酸化，致使轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物組裝失敗[24-26]。雖然氧化應(yīng)激可能導(dǎo)致某些定位于核仁的蛋白穿梭到核質(zhì)引發(fā)核仁應(yīng)激，但本文并未證明核仁應(yīng)激與氧化應(yīng)激直接相關(guān)，兩者的因果關(guān)系有待進(jìn)一步研究來(lái)闡明。

總之，我們證明了腎IRI中核仁應(yīng)激的發(fā)生，希望能從保護(hù)核仁結(jié)構(gòu)和功能完整的視角為減輕腎IRI損傷提供新的策略。