劉得水， 吳 雪， 李麗波， 興桂華， 高志影△

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院 1醫(yī)藥科學(xué)研究院， 2附屬第二醫(yī)院耳鼻喉科， 黑龍江 齊齊哈爾 161006)

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)是神經(jīng)生長因子家族的重要成員之一，它廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，可以調(diào)控腦的神經(jīng)發(fā)育、突觸傳遞和神經(jīng)突觸可塑性，影響腦的認(rèn)知、學(xué)習(xí)和記憶[1]，參與神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)和情緒調(diào)節(jié)[2]。在人類和嚙齒類動物模型中，BDNF功能紊亂與一些神經(jīng)系統(tǒng)紊亂有關(guān)，如抑郁癥[3]、老年癡呆[4]和亨廷頓舞蹈癥[5]等，但是BDNF的調(diào)控仍然有很多未知之處。BDNF對神經(jīng)發(fā)育和多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生的病理過程至關(guān)重要，因此，探究BDNF的精準(zhǔn)表達(dá)調(diào)控具有重要意義。

調(diào)控BDNF表達(dá)的機(jī)制非常復(fù)雜，它的轉(zhuǎn)錄過程通過多種啟動子驅(qū)動不同編碼轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物來調(diào)節(jié)，然而BDNF表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)也日益受到研究者的關(guān)注。微小RNA(microRNA，miRNA，miR)是長約19～23個(gè)核苷酸的非編碼RNA，與靶mRNA的3′-非翻譯區(qū)(3′-untranslated region，3′-UTR)部分序列反向互補(bǔ)結(jié)合，對靶基因的轉(zhuǎn)錄后水平進(jìn)行負(fù)性調(diào)控[6]。本課題組前期研究通過生物信息分析軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)miR-489-3p可以靶向結(jié)合BDNF的高度保守區(qū)序列，并且接近BDNF 3′-UTR的末端。miR-489-3p在中樞神經(jīng)系統(tǒng)廣泛表達(dá)，與神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有密切關(guān)系[7]。本項(xiàng)目旨在探究miR-489-3p是否是可以靶向調(diào)控BDNF，以期進(jìn)一步深入理解BDNF的表達(dá)調(diào)控機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞株

大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫。

2 主要試劑

DMEM/F12培養(yǎng)基和滅活胎牛血清購自HyClone；Lipofectamine 2000 購自Invitrogen；Taq酶、Reverse Transcriptase XL和dNTP Mixture購自TaKaRa；Luciferase Assay System購自Promega； 兔抗BDNF單克隆抗體(ab108319)購自Abcam；鼠抗GAPDH(sc-47724)單克隆抗體和HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG購自Santa Cruz。miR-489-3p mimic、 mimic control、miR-489-3p inhibitor和inhibitor control由吉瑪公司合成，序列見表1。Luciferase質(zhì)粒和RT-qPCR引物由金斯瑞公司根據(jù)設(shè)計(jì)合成，序列見表2和表3。

表1 合成miRNA的序列

3 主要方法

3.1轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染前1 d，接種1×105個(gè)細(xì)胞至24孔板中。細(xì)胞密度長至60%～70%融合度時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。配制Opti-MEM培養(yǎng)基+Lipofectamine 2000溶液；用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋重組質(zhì)粒、miR-489-3p mimic和miR-489-3p inhibitor,輕輕混勻，室溫放置20 min。棄掉原培養(yǎng)液，加入Opti-MEM培養(yǎng)基，并將上述混合液逐滴加入培養(yǎng)液中，6 h后換液，置于37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表2 Luciferase報(bào)告基因質(zhì)粒序列

表3 RT-qPCR引物序列

3.2Luciferase報(bào)告基因檢測 從NCBI上查找BDNF mRNA的3′-UTR序列及結(jié)合位點(diǎn)并設(shè)計(jì)BDNF 3′-UTR引物，構(gòu)建BDNF 3′-UTR野生質(zhì)粒(WT)和突變質(zhì)粒(Mut)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，收集細(xì)胞，裂解細(xì)胞，提取蛋白。加入底物，迅速混勻。在生物發(fā)光分析儀上測定螢火蟲螢光素酶和海腎螢光素酶的發(fā)光強(qiáng)度，以兩者的比值為相對螢光素酶活性。

3.3RT-qPCR實(shí)驗(yàn) 采用TRIzol一步法提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度法測定RNA的濃度及純度。逆轉(zhuǎn)錄，使用TaqMan探針法檢測miR-489-3p，SYBR Green嵌合熒光法檢測BDNF的mRNA水平，進(jìn)行RT-qPCR檢測，保存結(jié)果并分析。采用比較Ct值定量方法進(jìn)行相對定量，公式為2-ΔΔCt，其中ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct看家基因)實(shí)驗(yàn)組-(Ct目的基因-Ct看家基因)對照組。

3.4Western blot檢測 收集細(xì)胞，冰上裂解細(xì)胞20 min，12 000 r/min離心20 min，取上清。采用SDS-PAGE測定，每孔道加50 μg蛋白，用積層膠和分離膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。用抗BDNF和抗GAPDH抗體孵育4 ℃過夜，相應(yīng)的 II 抗孵育，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色。

3.5CCK-8法檢測細(xì)胞活力 轉(zhuǎn)染6 h細(xì)胞換液后，分別于12 h、24 h、36 h、48 h和60 h加入CCK-8試劑，反應(yīng)2 h，酶標(biāo)儀測吸光度(A)值。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.6EdU實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖能力 轉(zhuǎn)染后24 h，細(xì)胞消化下來，接種于48孔板中，培養(yǎng)至密度70%～90%；制備適量50 μmol/L EdU培養(yǎng)基；50 μmol/L EdU培養(yǎng)基孵育12 h，棄培養(yǎng)基；PBS洗細(xì)胞。4%多聚甲醛固定，甘氨酸孵育5 min，棄甘氨酸溶液，PBS洗；0.5% Triton X-100孵育10 min，PBS洗。Apollo染色，避光、室溫孵育30 min后；0.5% Triton X-100洗2次；甲醇洗2次；PBS洗。DAPI避光孵育10 min，棄染色反應(yīng)液；PBS洗。采集圖片，數(shù)據(jù)分析。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用Student’st檢驗(yàn)或單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 BDNF 3′-UTR 和miR-489-3p結(jié)合位點(diǎn)之間的相互作用

通過RNAhybrid和TargetScan軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)BDNF 3′-UTR 有2個(gè)miR-489-3p結(jié)合位點(diǎn)，見圖1。RNAhybrid軟件計(jì)算出其結(jié)合自由能預(yù)測值分別為-21.5和-18.3 kcal/mol。

Figure 1.Schematic description of the hypothetical duplexes formed by the interactions between the binding site in the BDNF 3′-UTR and miR-489-3p. The miR-489-3p seed sequence and the seed sequence-binding sites in the BDNF 3′-UTR are indicated in red.

圖1 生物信息學(xué)預(yù)測miR-489-3p靶向結(jié)合BDNF 3′-UTR

2 雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-489-3p靶向結(jié)合BDNF的3′-UTR

體外轉(zhuǎn)染增殖期PC12細(xì)胞24 h后，與對照組比較，轉(zhuǎn)染BDNF 3′-UTR螢光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒和miR-489-3p mimic的PC12細(xì)胞螢光素酶活性顯著降低(P<0.05)；轉(zhuǎn)染BDNF 3′-UTR螢光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒和miR-489-3p inhibitor的PC12細(xì)胞螢光素酶活性顯著升高(P<0.01)；轉(zhuǎn)染BDNF 3′-UTR螢光素酶報(bào)告基因突變質(zhì)粒和 miR-489-3p mimic或miR-489-3p inhibitor的PC12細(xì)胞螢光素酶活性的差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)，見圖2。

Figure 2.The relative luciferase activity in PC12 cells transfec-ted with wild-type (WT) or mutant (Mut) BDNF luciferase plasmid and with equal doses of mimic control, miR-489-3p mimic, inhibitor control or miR-489-3p inhibitor. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmimic control group;##P<0.01vsinhibitor control group.

圖2 雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測PC12細(xì)胞螢光素酶活性的變化

3 miR-489-3p在轉(zhuǎn)錄后水平靶向調(diào)控BDNF表達(dá)

我們將人工合成的 miR-489-3p mimic和miR-489-3p inhibitor分別轉(zhuǎn)染到PC12細(xì)胞，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-489-3p mimic顯著提高PC12細(xì)胞的miR-489-3p水平(P<0.01)，而轉(zhuǎn)染miR-489-3p inhibitor顯著降低了PC12細(xì)胞的miR-489-3p水平(P<0.01),見圖3A。過表達(dá)或抑制miR-489-3p對BDNF的mRNA表達(dá)水平并未見顯著影響(P>0.05)，見圖3B。與預(yù)期相似，當(dāng)miR-489-3p過表達(dá)時(shí)，BDNF的蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.01)，而轉(zhuǎn)染miR-489-3p inhibitor使BDNF的蛋白表達(dá)水平上調(diào)(P<0.05)，見圖3C。

4 轉(zhuǎn)染miR-489-3p mimics和anti-miR-489-3p inhibitor對PC12細(xì)胞增殖能力的影響

采用CCK-8法檢測PC12細(xì)胞活力，結(jié)果顯示，體外轉(zhuǎn)染 miR-489-3p mimics的PC12細(xì)胞活力顯著低于對照組(P<0.01)，而轉(zhuǎn)染anti-miR-489-3p inhibitor的PC12細(xì)胞活力則顯著高于對照組(P<0.05)，見圖4。

Figure 3.The levels of miR-489-3p (A), BDNF mRNA (B) and BDNF protein (C) in PC12 cells transfected with mimic control, miR-489-3p mimic, inhibitor control or miR-489-3p inhibitor. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsmimic control group;#P<0.05,##P<0.01vsinhibitor control group.

圖3 過表達(dá)或抑制miR-489-3p后PC12細(xì)胞miR-489-3p及BDNF的mRNA和蛋白表達(dá)的變化

Figure 4.The PC12 cell viability was measured at 12 h, 24 h, 36 h, 48 h and 60 h after transfection with equal doses of mimic control, miR-489-3p mimic, inhibitor control or miR-489-3p inhibitor. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsmimic control group;#P<0.05vsinhibitor control group.

圖4 過表達(dá)或抑制miR-489-3p表達(dá)對PC12細(xì)胞活力的影響

采用EdU實(shí)驗(yàn)檢測PC12細(xì)胞的增殖能力，結(jié)果顯示，體外轉(zhuǎn)染miR-489-3p mimic的PC12細(xì)胞增殖能力顯著低于對照組(P<0.01)，而轉(zhuǎn)染miR-489-3p inhibitor的PC12細(xì)胞增殖能力則顯著高于對照組(P<0.05),見圖5。

Figure 5.The proliferation of the PC12 cells transfected with equal doses of mimic control, miR-489-3p mimic, inhibitor control or miR-489-3p inhibitor was measured by EdU assay (×100). Mean±SD.n=3.**P<0.01vsmimic control group;#P<0.05vsinhibitor control group.

圖5 過表達(dá)或抑制miR-489-3p的表達(dá)對PC12細(xì)胞增殖的影響

討 論

BDNF與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)生存、分化和活動依賴性突觸可塑性有關(guān)。研究表明在出生后的發(fā)育過程中，BDNF可調(diào)控某些特定腦區(qū)神經(jīng)元的神經(jīng)結(jié)構(gòu)和脊柱形態(tài)[8]，尤其引人注目的是紋狀體、皮層和海馬體之間的差異。通過條件性BDNF敲除小鼠來分析皮層和海馬椎體神經(jīng)元以及來自這些腦區(qū)的抑制性神經(jīng)元和齒狀回的興奮性顆粒神經(jīng)元的神經(jīng)結(jié)構(gòu)和樹突形態(tài)，發(fā)現(xiàn)海馬齒狀回和皮質(zhì)抑制性神經(jīng)元和顆粒細(xì)胞的神經(jīng)結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損和樹突的復(fù)雜性顯著降低[9]。在神經(jīng)系統(tǒng)中，BDNF是一個(gè)通過多種形式積極參加調(diào)節(jié)神經(jīng)突觸可塑性的調(diào)制器[10]。BDNF與傳統(tǒng)的抗抑郁作用有關(guān)，抗抑郁藥增加海馬中BDNF的表達(dá)，而海馬中BDNF的缺失會減弱抗抑郁的行為反應(yīng)[11]。此外，腦室內(nèi)或海馬內(nèi)注射BNDF導(dǎo)致快速、持續(xù)的抗抑郁作用[12]。移植轉(zhuǎn)染了BDNF使之高表達(dá)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞顯著促進(jìn)腦梗死大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)和突觸素表達(dá)[13]。增加內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)BDNF的表達(dá)選擇性地減少乙醇依賴性小鼠的過量飲酒[14]。因此BDNF對神經(jīng)發(fā)育和多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生的病理過程至關(guān)重要，探究BDNF的精準(zhǔn)表達(dá)調(diào)控具有重要意義。

miRNAs是一種小型的、非編碼的RNA，它能夠靶向調(diào)控mRNA的翻譯，從而對動植物的生長發(fā)育和病理生理過程發(fā)揮關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)。在哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)中，mRNA翻譯的時(shí)空控制對神經(jīng)發(fā)育和突觸可塑性起著重要作用[15]。雖然哺乳動物的大腦中已經(jīng)鑒定出來了許多miRNAs，但能夠調(diào)控突觸功能的特異性miRNAs，以及它們的靶mRNA仍然還有許多未知。miR-489-3p是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中含量豐富的一種miRNAs，提示其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中有著極其重要的作用。因此，miRNA-489-3p也成為分子生物學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)備受關(guān)注的miRNA之一。Jiang等[7]研究報(bào)道，miR-489-3p抑制神經(jīng)細(xì)胞增殖和促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

本項(xiàng)研究通過生物信息預(yù)測和luciferase實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)miR-489-3p可以靶向結(jié)合BDNF的3′-UTR。通過進(jìn)一步的深入研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)或抑制miR-489-3p可靶向調(diào)控BDNF的蛋白表達(dá)，但對BDNF的mRNA表達(dá)并無顯著影響。以上結(jié)果再次驗(yàn)證了miR-489-3p可以在轉(zhuǎn)錄后水平靶向調(diào)控BDNF的表達(dá)。過表達(dá)miR-489-3p顯著抑制PC12細(xì)胞的增殖能力，而抑制miR-489-3p表達(dá)水平可以顯著提高PC12細(xì)胞的增殖能力，提示miR-489-3p通過轉(zhuǎn)錄后水平靶向負(fù)性調(diào)控BNDF表達(dá)并抑制神經(jīng)細(xì)胞增殖。

本研究為BDNF表達(dá)下調(diào)而引起的神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了一種新的分子機(jī)制。但是miR-489-3p負(fù)性靶向調(diào)控BDNF的表達(dá)對神經(jīng)系統(tǒng)具體功能的影響，有待今后通過不同的分子生物學(xué)方法進(jìn)一步深入研究。