朱明新 沈敢鋒 滕云

(浙江海正藥業(yè)股份有限公司，臺州 318000)

5-酮基米爾貝霉素是由米爾貝霉素制備米爾貝肟的中間體。米爾貝霉素(milbemycins)是由鏈霉菌產(chǎn)生的十六元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類驅(qū)蟲藥物，由日本三共株式會社于1967年發(fā)現(xiàn)[1]，經(jīng)過近20年的改良于1986年以米爾貝肟(milbemycin oxime)上市，為當(dāng)時(shí)唯一單一成分可以同時(shí)防治犬惡絲蟲及腸道寄生蟲的產(chǎn)品[2]。

米爾貝肟在中國、歐洲、日本、美國被廣泛用于控制和預(yù)防動(dòng)物體內(nèi)外大部分常見寄生蟲，具有很好的效果[3-5]。由于米爾貝肟殺蟲活性高、毒性小，LD50是臨床推薦用量的2000倍以上，同時(shí)對阿維菌素類藥物敏感的犬毒性較小，所以具有很好的市場前景[6]。

目前，米爾貝肟較為普遍是通過發(fā)酵半合成生產(chǎn)的[7-9]，主要步驟包括鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)米爾貝霉素A3/A4，米爾貝霉素A3/A4經(jīng)過氧化反應(yīng)生成5-酮基米爾貝霉素A3/A4，再經(jīng)過肟化反應(yīng)生成米爾貝肟A3/A4。由米爾貝霉素氧化生成5-酮基米爾貝霉素這一步驟存在氧化收率低，氧化劑價(jià)格昂貴，氧化所用催化劑易產(chǎn)生惡臭、環(huán)保壓力大的問題。

目前，海正藥業(yè)項(xiàng)目團(tuán)隊(duì)已經(jīng)開發(fā)了由基因改造鏈霉菌發(fā)酵直接產(chǎn)5-酮基米爾貝霉素[6]，經(jīng)提取純化后得到5-酮基米爾貝霉素晶體[10]，再經(jīng)一步肟化反應(yīng)生成米爾貝肟。該工藝簡化了合成路線，提高了收率，避免了氧化步驟帶來的環(huán)境污染。由于工藝路線變化較大，也會使得米爾貝肟的雜質(zhì)發(fā)生改變，所以有必要對中間體5-酮基米爾貝霉素的雜質(zhì)譜進(jìn)行系統(tǒng)性研究，滿足藥監(jiān)部門對雜質(zhì)研究日益提高的要求。

按照來源，原料藥中雜質(zhì)可以分為工藝雜質(zhì)(包括合成中未反應(yīng)完全的反應(yīng)物及試劑、中間體、副產(chǎn)物、從反應(yīng)物及試劑中混入的雜質(zhì)等)和降解產(chǎn)物(生產(chǎn)、貯藏、運(yùn)輸過程中因原料藥不穩(wěn)定產(chǎn)生的雜質(zhì))等[11]。

本研究對5-酮基米爾貝霉素的兩個(gè)工藝雜質(zhì)和兩個(gè)降解雜質(zhì)進(jìn)行了樣品制備、結(jié)構(gòu)鑒定和初步研究。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

5-酮基米爾貝霉素A3/A4粗品以及A3、A4單組分樣品都是由本公司實(shí)驗(yàn)室制得的小試樣品。硅膠(青島海洋化工有限公司生產(chǎn)，300～400目)；乙腈(Merck，色譜純)；DMSO(北京伊諾凱科技有限公司，分析純)；甲醇及其它試劑(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純)。

1.2 儀器

Agilent-1260高效液相色譜儀，Agilent-6540 QTof 質(zhì)譜儀，Bruker- Avance400核磁共振儀。

1.3 雜質(zhì)分離制備方法

1.3.1 工藝雜質(zhì)C、D的制備

5-酮基米爾貝霉素A3/A4粗品按照沈敢鋒等[10]專利中的方法制得，將粗品用甲醇溶解，加載至硅膠柱，上柱量約5g/L硅膠，用正庚烷-丙酮(95:5,V/V)洗脫。雜質(zhì)D、雜質(zhì)C、5-酮基米爾貝霉素A4、5-酮基米爾貝霉素A3依次被洗出，分段收集。將雜質(zhì)C、雜質(zhì)D純度高的部分分別混合后再濃縮降溫結(jié)晶，得到高純度的雜質(zhì)C和D。A3、A4單組分樣品亦是采用上述方法制得。

1.3.2 5-酮基米爾貝霉素A3堿降解雜質(zhì)及A4堿降解雜質(zhì)的制備

將5-酮基米爾貝霉素A3、A4單組分樣品分別溶于70%甲醇，再用1mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH至12.5左右，靜置4h，經(jīng)HPLC檢測堿降解較完全，再用1mol/L鹽酸回調(diào)pH至中性。分別加載至硅膠柱，上柱量約5g/L硅膠，用正庚烷-丙酮(95:5,V/V)洗脫，分段收集，將A3堿降解雜質(zhì)、A4堿降解雜質(zhì)純度高的部分分別混合并濃縮干即得到5-酮基米爾貝霉素A3堿降解雜質(zhì)、5-酮基米爾貝霉素A4堿降解雜質(zhì)。

1.4 分析方法

1.4.1 高效液相色譜(HPLC)分析條件

色譜柱：Aglient C18或C8反相柱(4.6mm×150mm,3.5μm)；流動(dòng)相：A相：0.01mol/L乙酸銨，B相：乙腈，梯度洗脫：0～60min，B相從70%升高至80%；波長：240nm；流速：1mL/min；進(jìn)樣量：10μL。該方法是基于黃雋等[12]論文中的分析方法進(jìn)行的優(yōu)化。

1.4.2 質(zhì)譜分析條件

離子源：電噴霧電離源(ESI)；離子極性：正離子；霧化器溫度：325℃；霧化器干氣流速：8L/min；噴霧器壓力：35psig；噴霧電壓：+3500V。取適量樣品于進(jìn)樣瓶中，用50%乙腈水溶液溶解、搖勻，作為樣品檢測溶液進(jìn)行質(zhì)譜分析。

1.4.3 液質(zhì)聯(lián)用分析條件

將“1.4.1”項(xiàng)的液相分析條件和“1.4.2”項(xiàng)的質(zhì)譜分析條件聯(lián)用，對樣品進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用分析。

1.4.4 核磁共振波譜分析條件

溶劑：丙酮，內(nèi)標(biāo)物：TMS。取適量樣品加入核磁管內(nèi)，加入約0.5mL DMSO試劑，振蕩使樣品充分溶解，作為樣品溶液，分別進(jìn)行核磁共振氫譜(1H NMR)、碳譜(13C NMR，DEPT135°)以及相關(guān)譜(1H-1H COSY、HSQC和HMBC)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 HPLC法分析5-酮基米爾貝霉素A3/A4粗品主要雜質(zhì)

采用HPLC法跟蹤5-酮基米爾貝霉素提取工藝各步驟料液組分的變化，發(fā)現(xiàn)粗品中雜質(zhì)C、D為兩個(gè)最主要的工藝雜質(zhì)，是菌體代謝過程產(chǎn)生的。雜質(zhì)C、D在發(fā)酵液及粗品HPLC圖譜中的位置如圖1～2所示。

2.2 強(qiáng)制降解實(shí)驗(yàn)

圖1 5-酮基米爾貝霉素發(fā)酵液的典型HPLC圖譜Fig.1 The typical HPLC chromatogram of 5-keto milbemycinA3/A4 fermentation broth

圖2 5-酮基米爾貝霉素A3/A4粗品的典型HPLC圖譜Fig.2 The typical HPLC chromatogram of 5-keto milbemycinA3/A4 crude product

將5-酮基米爾貝霉素A3/A4粗品進(jìn)行高溫、高濕、光照、氧化、酸堿等降解實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：高溫、高濕條件下樣品較穩(wěn)定；氧化、光照條件下樣品略微降解；堿性條件下粗品中A3、A4組分幾乎完全降解，雜質(zhì)E、F含量顯著增加。

加速穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)樣品穩(wěn)定性良好，降解緩慢。穩(wěn)定性數(shù)據(jù)如表1所示。

2.3 雜質(zhì)制備

采用“1.3”項(xiàng)方法制備工藝雜質(zhì)C、D及5-酮基米爾貝霉素A3單組分、A4單組分樣品，并根據(jù)“1.3.2”項(xiàng)的方法進(jìn)行堿降解試驗(yàn)，制備5-酮基米爾貝霉素A3堿降解雜質(zhì)和A4堿降解雜質(zhì)。圖3分別為A3單組分、A4單組分堿降解前后的HPLC對比圖譜。圖4為制備的4個(gè)雜質(zhì)與粗品的HPLC對比圖譜。

從圖4可以看出A3、A4單組分堿降解雜質(zhì)峰出峰時(shí)間分別與粗品溶液雜質(zhì)E、雜質(zhì)F出峰時(shí)間重合，它們可能分別為同一物質(zhì)。

2.4 雜質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定

經(jīng)質(zhì)譜、核磁共振譜分析，對上述制備的4個(gè)雜質(zhì)進(jìn)行了結(jié)構(gòu)確證，波普數(shù)據(jù)和結(jié)構(gòu)解析結(jié)果如下。

表1 5-酮基米爾貝霉素A3/A4粗品加速穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 The accelerated stability test results of 5-keto milbemycin A3/A4 crude product

圖3 5-酮基米爾貝霉素A3/A4單組分堿降解前后HPLC對比圖譜Fig.3 The comparison of HPLC chromatogram before and after alkaline degradation of 5-keto milbemycin A3/A4 single component

圖4 4個(gè)雜質(zhì)與A3/A4粗品的HPLC對比圖譜Fig.4 The comparison of HPLC chromatogram of A3/A4 crude sample with impurities

2.4.1 雜質(zhì)C

樣品質(zhì)譜圖中m/z=549.3187的離子峰為[M+Na]+的峰，表明該雜質(zhì)的分子量為526.7140，高分辨質(zhì)譜確定[M+Na]+549.3186峰的元素組成為C32H46NaO6，證明本品的元素組成為C32H46O6。核磁共振碳譜中共有32個(gè)碳信號，分別為6個(gè)伯碳原子，8個(gè)仲碳原子，11個(gè)叔碳原子，7個(gè)季碳原子。具體歸屬如下：

1H NMR(acetone-d6,400MHz),δ:6.60(s,1H,H-24),6.17～6.28(m,2H,H-17-18),5.30(dd,J=13.6,9.9Hz,1H,H-16),5.18～5.26(m,1H,H-2),4.94～4.96(m,1H,H-12),4.12(s,1H,H-26-OH),3.95(s,1H,H-25),3.58～3.65(m,1H,H-9),3.12(t,J=9.4Hz,1H,H-5),2.99(d,J=16.1Hz,1H,H-21),2.53(m,1H,H-15),2.17～2.27(m,4H,H-11-14-21),2.00(dd,J=11.4,3.7Hz,1H,H-3),1.85～1.93(m,5H,H-20-10-14),1.78(s,3H,H-32),1.62～1.71(m,5H,H-30-8-27),1.48～1.59(m,3H,H-7-8),1.28～1.37(m,3H,H-3-27-6),1.03(d,J=6.4Hz,3H,H-31),0.96(t,J=7.2Hz,3H,H-28),0.79～0.91(m,4H,H-29-10);13C NMR(acetone-d6,125MHz),δ:197.08(C-22),172.01(C-1),141.22(C-16),139.07(C-24),137.85(C-19),136.98(C-13),136.00(C-23),126.38(C-17),125.59(C-18),121.86(C-12),98.08(C-4),80.51(C-26),76.59(C-5),69.24(C-2),68.58(C-9),49.35(C-14),49.31(C-25),48.86(C-21),42.28(C-3),37.12(C-10-15),36.47(C-8),35.34(C-11),35.21(C-6),28.73(C-7),26.51(C-27),22.40(C-31),18.10(C-29),16.26(C-30),15.78(C-32),14.41(C-20),10.44(C-28)。

2.4.2 雜質(zhì)D

樣品質(zhì)譜圖中m/z=509.3264的離子峰為[M+H]+的峰，表明該雜質(zhì)的分子量為508.6990，高分辨質(zhì)譜確定[M+H]+509.3264峰的元素組成為C32H45O5，證明本品的元素組成為C32H44O5。核磁共振碳譜中共有32個(gè)碳信號，分別為6個(gè)伯碳原子，7個(gè)仲碳原子，11個(gè)叔碳原子，8個(gè)季碳原子。具體歸屬如下：

1H NMR(acetone-d6,400MHz),δ:8.71(s,1H,H-22-OH),7.33(s,1H,H-24),6.70(s,1H,H-21),6.19(dd,J=14.9,11.0Hz,1H,H-17),5.61(d,J=10.8Hz,1H,H-18),5.39～5.45(m,1H,H-2),5.25(dd,J=15.0,9.6Hz，1H,H-16),4.93(d,J=10.2Hz,1H,H-12),3.67～3.73(m,1H,H-9),3.13(t,J=9.2Hz,1H,H-5),2.47～2.59(m,1H,H-15),2.26～2.29(m,1H,H-11),2.14～2.22(m,5H,H-32-11-14),2.04～2.05(m,3H,H-20),1.96～1.99(m,1H,H-10),1.86～1.93(m,2H,H-3-14),1.69～1.75(m,1H,H-27),1.65(s,3H,H-30),1.58～1.63(m,1H,H-27),1.45～1.55(m,3H,H-7-8),1.27～1.37(m,3H,H-3-27-6),0.98(t,J=7.3Hz,3H,H-28),0.80(d,J=6.6Hz,3H,H-29),0.74～0.77(m,1H,H-10);13C NMR(acetone-d6,125MHz),δ:168.49(C-1),157.16(C-22),144.19(C-26),139.50(C-16),135.67(C-13),134.77(C-19),131.94(C-24),128.05(C-18),125.78(C-17),122.79(C-23),122.77(C-25),121.40(C-12),113.81(C-21),97.28(C-4),75.67(C-5),67.70(C-9),67.44(C-2),48.43(C-14),41.44(C-3),36.70(C-10),36.14(C-15),35.60(C-8),34.33(C-6),33.69(C-11),27.83(C-7),25.63(C-27),21.14(C-31),17.57(C-20),17.15(C-29),15.40(C-30),14.76(C-32),9.54(C-28)。

2.4.3 A3堿降解雜質(zhì)

樣品質(zhì)譜圖中m/z=509.4380的離子峰為[M+H]+的峰，表明該雜質(zhì)的分子量為508.6550，高分辨質(zhì)譜確定[M+H]+509.4380峰的元素組成為C31H41O6，證明本品的元素組成為C31H40O6。核磁共振碳譜中共有31個(gè)碳信號，分別為5個(gè)伯碳原子，7個(gè)仲碳原子，10個(gè)叔碳原子，9個(gè)季碳原子。具體歸屬如下：

1H NMR(acetone-d6,400MHz),δ:9.53(s,1H,H-22-OH),6.92(s,1H,H-24),6.17～6.20(m,1H,H-18),5.92～6.01(m,1H,H-17),5.53(dd,1H,H-16),5.24～5.31(m,3H,H-2-20),5.07～5.09(m,1H,H-12),3.57～3.66(m,1H,H-9),3.25～3.30(m,1H,H-5),2.46～2.56(m,1H,H-15),2.24～2.31(m,1H,H-14),2.10～2.18(m,6H,H-10-11-31),2.04～2.07(m,1H,H-3),1.84～1.90(m,1H,H-14),1.55～1.56(m,1H,H-8),1.43～1.47(m,6H,H-7-8-29),1.18～1.21(m,2H,H-3-6),1.13(d,3H,H-27),0.99(d,3H,H-30),0.85～0.91(m,1H,H-10),0.80(d,3H,H-28);13C NMR(acetone-d6,125MHz),δ:167.14(C-1),151.32(C-21),143.13(C-22),142.91(C-16),123.34(C-18),122.35(C-12),117.49(C-25),97.66(C-4),74.25(C-20),71.10(C-5),69.10(C-2),67.80(C-9),48.29(C-14),41.49(C-3),36.53(C-6),36.06(C-10),35.54(C-8),35.41(C-15),34.32(C-11),27.81(C-7),22.54(C-30),19.83(C-27),18.22(C-28),16.01(C-31),15.51(C-29)。

2.4.4 A4堿降解雜質(zhì)

樣品質(zhì)譜圖中m/z=523.4401的離子峰為[M+H]+的峰，表明該雜質(zhì)的分子量為522.682，高分辨質(zhì)譜確定[M+H]+523.4401峰的元素組成為C32H43O6，證明本品的元素組成為C32H42O6。核磁共振碳譜中共有32個(gè)碳信號，分別為5個(gè)伯碳原子，8個(gè)仲碳原子，10個(gè)叔碳原子，9個(gè)季碳原子。具體歸屬如下：

1H NMR(acetone-d6,400MHz),δ:9.60(s,1H,H-22-OH),6.93(s,1H,H-24),6.19～6.22(m,1H,H-18),5.94～6.01(m,1H,H-17),5.52(dd,J=9.6Hz,9.8Hz,1H,H-16),5.19～5.34(m,3H,H-2-20),5.04～5.07(m,1H,H-12),3.61～3.67(m,1H,H-9),3.04～3.09(m,1H,H-5),2.44～2.55(m,1H,H-15),2.23～2.25(m,1H,H-14),2.06～2.17(m,7H,H-3-10-11-32),1.87(t,J=11.8Hz,1H,H-14),1.65～1.70(m,1H,H-27),1.55～1.56(m,1H,H-8),1.47(s,3H,H-30),1.43～1.44(m,3H,H-7-8),1.18～1.35(m,3H,H-3-27-6),0.96～1.0(m,6H,H-28-31),0.83～0.92(m,1H,H-10),0.78(d,J=6.2Hz,3H,H-29);13C NMR(acetone-d6,125MHz),δ:167.07(C-1),151.33C-21),143.16(C-22),142.89(C-16),136.68(C-13),132.63(C-19),126.08(C-23),125.57(C-24),124.97(C-17),124.23(C-26),123.35(C-18),122.24(C-12),117.50(C-25),97.48(C-4),75.73(C-5),74.23(C-20),69.07(C-2),67.78(C-9),48.24(C-14),41.69(C-3),36.15(C-10),35.45(C-8),35.37(C-15),34.37(C-6),34.31(C-11),27.98(C-7),25.70(C-27),22.49(C-31),18.08(C-29),16.02(C-32),15.53(C-30),10.50(C-28)。

4個(gè)雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)式及1H-1H COSY和HMBC相關(guān)信號圖如圖5～6所示。

2.5 雜質(zhì)的來源及去向分析

為了進(jìn)一步確認(rèn)雜質(zhì)E、F與5-酮基米爾貝霉素A3、A4單組分堿降解雜質(zhì)是否存在對應(yīng)關(guān)系，采用液質(zhì)聯(lián)用檢測分析了5-酮基米爾貝霉素A3/A4粗品溶液。

雜質(zhì)E對應(yīng)的質(zhì)譜圖中m/z=509.4320的離子峰為[M+H]+的峰，表明該雜質(zhì)的分子量為508.6，高分辨質(zhì)譜確定[M+H]+509.4320峰的元素組成為C31H41O6，推測該雜質(zhì)的元素組成為C31H40O6，分子量和分子式與A3堿降解雜質(zhì)相同。雜質(zhì)F對應(yīng)的質(zhì)譜圖中m/z=523.4401的離子峰為[M+H]+的峰，表明該雜質(zhì)的分子量為522.6，高分辨質(zhì)譜確定[M+H]+523.4401峰的元素組成為C32H43O6，推測該雜質(zhì)的元素組成為C32H42O6，分子量和分子式與A4堿降解雜質(zhì)相同。這就證實(shí)了雜質(zhì)E即為A3堿降解雜質(zhì)，雜質(zhì)F即為A4堿降解雜質(zhì)。這兩個(gè)雜質(zhì)在粗品溶液中含量較少，可見堿性條件能加速A3、A4分別降解成E、F這兩個(gè)雜質(zhì)。

對比5-酮基米爾貝霉素A3/A4及雜質(zhì)C～F結(jié)構(gòu)式可以看出：(1)雜質(zhì)C為A4第6、27位碳之間的氧開環(huán)后的產(chǎn)物；雜質(zhì)D的結(jié)構(gòu)就是雜質(zhì)C的酮基轉(zhuǎn)變成更加穩(wěn)定的烯醇式結(jié)構(gòu)。這與Nonaka等[13]的研究分析一致，雜質(zhì)C即文獻(xiàn)中的雜質(zhì)Milβ6(1b)，雜質(zhì)D即文獻(xiàn)中的雜質(zhì)Milβ3(5b)。雜質(zhì)C含有酮基可參與肟化反應(yīng)，如圖7所示，雜質(zhì)D不含酮基，因此不能進(jìn)行肟化反應(yīng)，這也正好與肟化實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

圖5 4個(gè)雜質(zhì)及5-酮基米爾貝霉素A3/A4的結(jié)構(gòu)式Fig.5 The structural formula of the four impurities and 5-keto milbemycin A3/A4

圖6 4個(gè)雜質(zhì)的1H-1H COSY和HMBC相關(guān)信號圖Fig.6 1H-1H COSY and HMBC correlations of the four impurities

雜質(zhì)C肟化后的產(chǎn)物也有部分殘留于最終的米爾貝肟成品中；雜質(zhì)D不能肟化，在肟化反應(yīng)后的純化步驟中去除較徹底。

(2)A3堿降解雜質(zhì)(雜質(zhì)E)及A4堿降解雜質(zhì)(雜質(zhì)F)分別為A3、A4的5位上酮基轉(zhuǎn)變?yōu)橄┐际浇Y(jié)構(gòu)的產(chǎn)物，如圖8所示。雜質(zhì)F即為Wang等[14]公開的米爾貝霉素α31。

雜質(zhì)E、F都不含酮基，故不能進(jìn)行肟化反應(yīng)，在肟化反應(yīng)后的純化步驟中去除較徹底。

3 結(jié)論

由此可見，中間體5-酮基米爾貝霉素中雜質(zhì)C的含量對成品米爾貝肟的雜質(zhì)含量會有較大影響，所以對5-酮基米爾貝霉素中雜質(zhì)C的限度應(yīng)進(jìn)行進(jìn)一步研究。

圖7 雜質(zhì)C肟化反應(yīng)Fig.7 The oximation reaction of impurity C

圖8 5-酮基米爾貝霉素A3/A4堿降解Fig.8 The alkaline degradation of 5-keto milbemycin A3/A4

上述相關(guān)雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)確證及相互間的關(guān)系，可以為5-酮基米爾貝霉素生產(chǎn)工藝改進(jìn)、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)完善以及產(chǎn)品質(zhì)量提高提供參考。對于會參與肟化反應(yīng)生成米爾貝肟相關(guān)雜質(zhì)的5-酮基米爾貝霉素相關(guān)雜質(zhì)的雜質(zhì)譜還需要更詳細(xì)的研究，以便確定相關(guān)雜質(zhì)的限度。