胡文靜，梁秀梅，高致富，高德榮，程順和

(1.江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部長江中下游小麥生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室，江蘇揚(yáng)州 225007；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)/河南糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心，河南鄭州 450002)

我國小麥品種中常用的矮稈基因有Rht1、Rht2和Rht8[1-2]。其中Rht1和Rht2來自農(nóng)林10號，為隱性半致矮基因，是赤霉素反應(yīng)遲鈍型矮稈基因，分別位于小麥染色體4B和4D短臂上，Rht8來自日本赤小麥(Akakomugi)，位于小麥2D染色體短臂上，對赤霉素反應(yīng)敏感[3]。近年來，小麥矮稈基因的遺傳基礎(chǔ)研究取得了顯著進(jìn)展，Rht1(Rht-B1b)、Rht2(Rht-D1b)、Rht3(Rht-B1c)和Rht10(Rht-D1c)分別被克隆[4-5]，其他矮稈基因的研究也取得了一定的進(jìn)展[6-7]，不同學(xué)者利用分子標(biāo)記相繼定位出50多個株高相關(guān)QTL[8]。不同的矮稈基因?qū)r(nóng)藝性狀具有不盡相同的影響。唐 娜等[9]研究表明，Rht8對小麥品種的有效分蘗以及千粒重沒有負(fù)面影響，同時還增加了穗粒數(shù)，尤其是提高了穗頂部和穗基部的結(jié)實率。另有研究發(fā)現(xiàn)，赤霉素不敏感型矮稈基因雖然通過增加穗粒數(shù)可以增加產(chǎn)量，但卻降低了粒重和蛋白質(zhì)含量[10]，一部分矮稈基因在降低株高的同時降低了小麥的水分利用效率[8]，另外有一部分矮稈基因會引起小麥生物產(chǎn)量大幅下降[11]。

眾所周知，矮稈基因在小麥遺傳改良中發(fā)揮了重要作用，矮化育種有賴于矮源和矮稈基因的發(fā)掘和利用。目前生產(chǎn)中應(yīng)用的小麥品種遺傳背景狹窄，僅有少數(shù)矮稈基因能被應(yīng)用于小麥育種中[12]。因此，深入分析新型矮稈基因的遺傳效應(yīng)，明確其應(yīng)用價值，創(chuàng)造或篩選新的矮稈種質(zhì)，對拓寬小麥矮源和促進(jìn)小麥矮化育種都具有重要的作用。

揚(yáng)麥17是江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所育成的優(yōu)質(zhì)多抗小麥品種，寧麥18是江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院育成的高產(chǎn)抗病小麥品種[13]。本研究以揚(yáng)麥17和寧麥18創(chuàng)制的310個F2植株為材料構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，并結(jié)合F2和F2:3群體的田間表型數(shù)據(jù)進(jìn)行小麥株高性狀的QTL定位及分析，以期發(fā)掘新的株高性狀QTL，為矮稈新材料的培育和矮稈新基因的挖掘提供理論和技術(shù) 支撐。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 植物材料

供試群體親本為普通小麥品種揚(yáng)麥17和寧麥18。揚(yáng)麥17由江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所育成，株高88～91 cm，莖稈韌性很好，抗倒、抗病、優(yōu)質(zhì)、多穗。寧麥18由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院育成，株高83～86 cm，矮稈、大穗。本研究以寧麥18為父本、揚(yáng)麥17為母本雜交獲得F1代，F(xiàn)1自交得到310株F2植株，F(xiàn)2按單株收，繁殖獲得F2:3群體。

1.1.2 引物

參考Roder等[14]、Song等[15](http://www.scabusa.org)、Sourdille等[16]、Guyomarc’h等[17]和Li等[18]提供的序列信息，選取可覆蓋小麥大部分基因組的2 403對不同來源的SSR引物。引物由上海捷瑞生物有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 田間試驗和表型調(diào)查

親本材料、F2植株及其F2:3家系分別于2015-2016年度、2016-2017年度連續(xù)兩個生長季節(jié)種植于江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所灣頭基地試驗田。其中，F(xiàn)2群體按單株種植；F2:3家系按株行種植，2次重復(fù)；行長1.3 m，行距35 cm，每行點播30粒，栽培管理同大田生產(chǎn)，小麥生長季未見嚴(yán)重病蟲害和倒伏。

小麥灌漿后期調(diào)查主莖株高。親本分別調(diào)查50株；F2群體調(diào)查每個單株；F2:3群體按株行調(diào)查，每行隨機(jī)選取10株，取平均值，并調(diào)查2個 重復(fù)。

1.2.2 DNA提取和PCR擴(kuò)增

取親本和F2群體的苗期葉片，采用CTAB法提取DNA。PCR體系與程序參考Taq酶(北京天根生化科技有限公司)說明書，其中循環(huán)數(shù)為35，退火溫度視不同引物而定，延伸時間為45 s。采用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，銀染檢測，觀察記錄結(jié)果并拍照保存。

1.2.3 表型數(shù)據(jù)分析

利用Microsoft Excel 2007軟件對表型數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，利用SPSS 22.0對親本的株高進(jìn)行獨立樣本t測驗，并對F2:3群體的株高性狀進(jìn)行描述性統(tǒng)計分析。

1.2.4 連鎖圖譜的構(gòu)建和QTL分析

利用JoinMap 4.0軟件并采用Kosambi函數(shù)構(gòu)建遺傳圖譜，使用WinQTLCart 2.5軟件選擇復(fù)合區(qū)間作圖法進(jìn)行QTL定位分析[19]，若LOD值>2.5，就認(rèn)為該處存在一個有效的QTL，同時分析其加性效應(yīng)、顯性效應(yīng)和貢獻(xiàn)率。以“Q+性狀名稱縮寫+染色體名稱”的方式[20]對QTL進(jìn)行命名。

2 結(jié)果與分析

2.1 表型性狀

統(tǒng)計分析顯示(表1)，兩個親本在株高性狀上表現(xiàn)為極顯著差異。F2和F2:3群體中的偏度和峰度的絕對值都小于1，即滿足正態(tài)分布(圖1)。同時，株高性狀存在明顯的雙向超親分離現(xiàn)象，表明均為多基因控制的數(shù)量性狀，適合進(jìn)行QTL定位。

表1 親本及其F2和F2:3群體的株高表型數(shù)據(jù)Table 1 Phenotypic values for plant height of two parents,the F2 and F2:3 populations in wheat cm

**:雙親間差異極顯著(P<0.01)。

**：Significant difference between parents(P<0.01).

圖1 揚(yáng)麥17/寧麥18 F2:3群體株高的表型分布

2.2 遺傳連鎖圖譜構(gòu)建結(jié)果

參考梁秀梅[21]遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建，利用實驗室選取的2 403對SSR引物在揚(yáng)麥17和寧麥18之間進(jìn)行多態(tài)性篩選，得到330對在親本間具有多態(tài)性的引物，多態(tài)性引物檢出率為13.7%。采用JoinMap 4.0作圖軟件構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，將其中的215個SSR標(biāo)記定位在19條染色體上(1D、6A未覆蓋到)，該圖譜共覆蓋1 717 cM，標(biāo)記間平均距離為7.99 cM[21]。

2.3 QTL定位分析

應(yīng)用復(fù)合區(qū)間作圖法共定位到8個株高QTL，分別位于小麥的2D、4B、5A、5B和7A上染色體上，其中，QPh-YN-2D.1、QPh-YN-5A.1、QPh-YN-5B.2和QPh-YN-7A四個QTL在兩個世代中均檢測到，QPh-YN-2D.2、QPh-YN-4B、QPh-YN-5A.2和QPh-YN-5B.1四個QTL僅在一個世代中檢測到。

QPh-YN-2D.1位于標(biāo)記Xcfd53～Xgwm4080之間，染色體上遺傳位置是6.8 cM，在兩世代中可解釋的表型變異分別為2.84%和 6.37%，LOD值分別為2.56和5.75，矮稈效應(yīng)增效等位基因來自寧麥18。QPh-YN-5A.1位于標(biāo)記Xwmc415～Xbarc360之間，染色體上遺傳位置是44.9 cM，在兩世代中可解釋的表型變異分別為 14.36%和20.46%，LOD值分別為8.69和12.82，矮稈效應(yīng)增效等位基因來自揚(yáng)麥17。QPh-YN-5B.2位于標(biāo)記Xgpw499～Xmag3262之間，染色體上遺傳位置是76.4 cM，在兩世代中可解釋的表型變異分別為4.26%和5.46%，LOD值均為3.51，顯性效應(yīng)為負(fù)，矮稈效應(yīng)增效等位基因來自寧麥18。QPh-YN-7A位于標(biāo)記Xmag4044～Xmag3284之間，染色體上遺傳位置是16.5cM，在兩世代中可解釋的表型變異分別為2.15%和3.16%，LOD值分別為2.55和 4.38，矮稈效應(yīng)增效等位基因來自寧麥18。

圖2 小麥株高性狀QTL在染色體上的分布

QPh-YN-2D.2僅能在F2世代中檢測到，位于標(biāo)記Xgpw5092～Xgpw4450之間，染色體上遺傳位置是100.6 cM，與QPh-YN-2D.1相距93.8 cM，推測是不同的QTL，可解釋的表型變異為 5.05%，LOD值為4.59，矮稈效應(yīng)增效等位基因來自寧麥18。QPh-YN-5A.2也僅能在F2世代中檢測到，位于標(biāo)記Xgwm186～Xbarc303之間，染色體上遺傳位置是71.2 cM，與QPh-YN-5A.1相距26.3 cM，推測是相同的QTL，LOD值為3.51，可解釋的表型變異為7.72%，矮稈效應(yīng)增效等位基因來自揚(yáng)麥17。QPh-YN-5B.1僅能在F2:3世代中檢測到，位于標(biāo)記Xgpw4463～Xgpw5206之間，染色體上遺傳位置是65.6 cM，與QPh-YN-5B.2相距10.8 cM，推測是同一QTL，LOD值為2.95，可解釋的表型變異為 4.62%，顯性效應(yīng)為負(fù)，矮稈效應(yīng)增效等位基因來自寧麥18。QPh-YN-4B也僅能在F2:3世代中檢測到，位于標(biāo)記Xmag1163～Xgwm538之間，染色體上遺傳位置是2 cM，LOD值為4.89，可解釋的表型變異為11.24%，顯性效應(yīng)為負(fù)，矮稈效應(yīng)增效等位基因來自寧麥18。

表2 揚(yáng)麥17/寧麥18的F2和F2:3群體株高的QTL定位結(jié)果Table 2 QTL mapping result for plant height in the F2 and F2:3 population of Yangmai 17/Ningmai 18

加性效應(yīng)：正值表示增效基因來自揚(yáng)麥17；負(fù)值表示增效基因來自寧麥18。顯性效應(yīng)：正值表示雜合子表現(xiàn)值比兩純合子的平均表現(xiàn)值高，負(fù)值表示雜合子表現(xiàn)值比兩純合子的平均值表現(xiàn)值低。

Additive effect:Positive additive effect indicates increased effect from Yangmai 17,and negative additive effect indicates increase effect from Ningmai 18.Dominant effect:Positive values indicate that the heterozygotes have the higher phenotypic values than the respective means of the two homozygotes,and negative values indicate that the heterozygotes have the lower phenotypic values than the respective means of the two homozygotes.

3 討 論

3.1 QTL的比較分析

QPh-YN-5A.1在兩世代中可以解釋的表型變異為14.36%和20.46%，是一個穩(wěn)定的主效QTL。已知矮稈基因Rht12位于5AL染色體上，緊密連鎖的分子標(biāo)記是Xgwm291[22]，經(jīng)過比對發(fā)現(xiàn)QPh-YY-5A.1與之相距較遠(yuǎn)[16]。參考Wang等[23]90K芯片圖譜和中國春(CS)V1.0版本基因組(http://plants.ensembl.org/Triticum_aestivum/Info/Index)也發(fā)現(xiàn)QPh-YN-5A.1與已報道[24]的5A上株高QTL相距較遠(yuǎn)。因此推測QPh-YY-5A.1是一個新的株高QTL。QPh-YN-5A.2僅能在F2世代中檢測到，與QPh-YN-5A.1相距26.3 cM，推測是相同QTL。QPh-YN-2D.1與已報道的2DS上矮稈基因Rht8的特異分子標(biāo)記Xgwm261[25]遺傳距離僅6.8 cM，因此推測此QTL是Rht8的位點。QPh-YN-2D.2僅能在F2世代中檢測到，與QPh-YN-2D.1相距93.8 cM，推測是不同的QTL，與中國春比對發(fā)現(xiàn)QPh-YN-2D.2位于2DL上，不同于以往報道的株高QTL，推測是一個新的株高QTL。經(jīng)過與中國春比對發(fā)現(xiàn)QPh-YN-5B.2位于5BL上，與葉亞瓊等[26]報道的Qph.acs5B相距較遠(yuǎn)，推測是一個新的株高QTL。QPh-YN-5B.1僅能在F2:3世代中檢測到，與QPh-YN-5B.2相距10.8 cM，推測是同一QTL。經(jīng)過與中國春比對發(fā)現(xiàn)QPh-YN-7A位于7AL上，與葉亞瓊等[26]報道的QPh.acs-7A.1距離相近，推測是同一個QTL。經(jīng)過與中國春比對發(fā)現(xiàn)QPh-YN-4B位于4BS上。經(jīng)基因型分析，Rht-B1b的KASP標(biāo)記在寧麥18和揚(yáng)麥17中均呈陽性，說明QPh-YN-4B不屬于Rht-B1b的位點，該位點未見報道[25,26-27]，推測是一個新的株高QTL。

3.2 矮稈基因的顯性或者上位性效應(yīng)

比對結(jié)果表明，QPh-YN-4B和QPh-YN-5B分別是兩個新的株高QTL，顯性效應(yīng)均為負(fù)值，表示后代中雜合子表現(xiàn)值比兩純合子的平均表現(xiàn)值低，說明這兩個矮稈基因具有一定的顯位效應(yīng)或者上位性效應(yīng)。

3.3 QTL的穩(wěn)定性和表型貢獻(xiàn)率

定位到的8個QTL中，只有QPh-YN-2D.1、QPh-YN-5A.1、QPh-YN-5B.2和QPh-YN-7A能夠同時在兩世代中被檢測到，是穩(wěn)定遺傳的QTL；QPh-YN-2D.2、QPh-YN-5A.2、QPh-YN-5B.1、QPh-YN-4B只能在單一世代被檢測到，而且大多數(shù)株高性狀QTL的貢獻(xiàn)率較低，只有QPh-YN-5A.1在兩世代表型貢獻(xiàn)率達(dá)到 14.36%和20.46%，QPh-YN-4B在F2:3世代中的表型貢獻(xiàn)率達(dá)到11.24%，其他株高QTL對表型的貢獻(xiàn)率均小于10%，這是因為株高性狀屬于數(shù)量遺傳性狀，并且供試群體F2和F2:3屬于低世代臨時性群體，F(xiàn)2世代僅調(diào)查單株主莖的表型性狀，易受環(huán)境影響，表型調(diào)查誤差大。我們后續(xù)會增加重組自交系群體多環(huán)境試點以增加結(jié)果的可靠性和穩(wěn)定性，以期尋找到在不同環(huán)境下穩(wěn)定表達(dá)的株高性狀QTL。

3.4 群體大小和圖譜密度對QTL檢測結(jié)果的影響

以往研究表明，QTL檢測結(jié)果受圖譜密度和圖譜長度的影響[28]。本研究所利用的揚(yáng)麥17/寧麥18群體包括310個F2單株及F2:3家系，基于SSR標(biāo)記構(gòu)建的連鎖圖譜進(jìn)行QTL檢測，最終有215個標(biāo)記定位到小麥的19條染色體上，圖譜覆蓋1717 cM，標(biāo)記間平均圖距為7.99 cM，由于SSR標(biāo)記密度有限，遺傳連鎖圖譜沒有完全覆蓋到染色體，可能造成部分染色體上QTL的漏檢，我們后續(xù)會應(yīng)用覆蓋小麥全基因組的55K芯片掃描重組自交系群體構(gòu)建更加精密的遺傳連鎖圖普以增加QTL定位結(jié)果的可靠性。

3.5 QTL位點的緊密連鎖

矮稈QTLQPh-YN-5A.1與梁秀梅等[21]在5A上定位到的總小穗數(shù)QTL相距11.5～14.5 cM，增效等位基因都來自揚(yáng)麥17，推測二者是連鎖QTL，另一矮稈QTLQPh-YN-2D.1與梁秀梅等[21]定位到的穗長QTLQSl-2D.2相距3～15 cM，增效等位基因都來自寧麥18，推測二者是連鎖QTL。利用這些緊密連鎖QTL，結(jié)合穩(wěn)定表達(dá)的位點，通過回交和分子標(biāo)記輔助選擇，可同時聚合控制多個性狀不同位點的等位基因，從而創(chuàng)制出優(yōu)異的小麥種質(zhì)資源。

致謝:感謝中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所夏先春博士在KASP基因分型方面提供的技術(shù)支持。