2 羅玉雙2 張保平 張建平2

(1.湖南文理學院生命與環(huán)境科學學院，湖南 常德 415000； 2.環(huán)洞庭湖水產健康養(yǎng)殖及加工湖南省重點實驗室，動物學湖南省高校重點實驗室，湖南 常德 415000； 3.常德職業(yè)技術學院農林工程系，湖南 常德 415000)

細菌性爛鰓病是由柱狀黃桿菌(Flavobacteriumcolumnare)引起草魚的常見疾病。柱狀黃桿菌屬于黃桿菌目，黃桿菌科，黃桿菌屬，具有滑動能力和團聚性，在世界范圍內的水體環(huán)境和土壤中均有分布，幾乎所有的淡水魚類均對該菌敏感，可導致被感染魚類出現(xiàn)爛鰓、體表潰瘍等癥狀，使集約化養(yǎng)殖魚類大規(guī)模死亡[1]。

卵黃抗體(IgY)作為1種免疫球蛋白，是1種高產、優(yōu)質的多克隆抗體。目前已有卵黃抗體針對沙門氏菌[2]、金黃色葡萄球菌[3]、幽門螺桿菌[4]、大腸桿菌[5]等病原菌的相關研究，但針對柱狀黃桿菌所進行的免疫學研究資料還很缺乏[6]。本研究以從患典型爛鰓病草魚病變部位中分離并鑒定的1株柱狀黃桿菌(FC-3株)作為免疫原[7]，免疫產蛋母雞，收取雞蛋制備特異性IgY，并以此IgY為基礎建立間接ELISA檢測方法，以期為該菌的檢測提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要儀器：臺式高速冷凍離心機(上海盧湘儀器有限公司)，多功能微孔板檢測儀(北京平皓生物有限公司)，超細勻漿機(河南省鞏義市予華儀器有限責任公司)，立式高壓蒸汽滅菌鍋(申安醫(yī)療器械廠)，麥氏比濁管、生化培養(yǎng)箱、超凈臺(中國上海浦東物理光學儀器廠)，聚苯乙烯酶標板(上海塑料三廠)，移液器(德國Eppendorf)。

1.1.2主要試劑：Shieh營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、Shieh瓊脂培養(yǎng)基(本實驗室自制)，細菌微量發(fā)酵管(杭州天和有限公司)，福氏完全佐劑與福氏不完全佐劑(Sigma公司)，卡拉膠、低甲氧基果膠(天津市福辰化學試劑廠)，預染低分子量蛋白質Marker(14.4～97.4 ku)、辣根過氧化物酶(HRP)標記兔抗雞IgY、標準雞IgY(北京鼎國昌盛生物有限責任公司)，牛血清白蛋白(BSA)、TMB底物顯色試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)。

1.1.3試驗動物：120日齡純種健康桃源蛋雞10只，購自桃源縣良種場；ICR雌性性成熟小白鼠15只，購自湖南省實驗動物中心。

1.1.4試驗菌株：柱狀黃桿菌分離株(FC-3株)、嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)、哈維氏菌(Vibrioharveyi)均為本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1柱狀黃桿菌的分離鑒定：無菌條件下取患有典型爛鰓病的草魚樣本病料組織(體表潰爛組織、鰓絲、內臟等)，加入滅菌生理鹽水研磨勻漿，無菌操作涂布菌液勻漿于Shieh瓊脂培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)16～18 h。挑取優(yōu)勢菌落，采用三線法平板劃線分離出單菌落，觀察菌落形態(tài)。取分離的病原菌接種于細菌微量發(fā)酵管中，28 ℃培養(yǎng)觀察并記錄生化反應結果。分離菌進行人工回歸試驗鑒定致病性。

1.2.2免疫原油佐劑滅活疫苗的制備

1.2.2.1分離菌免疫原處理：將分離菌先用Shieh營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)18 h，然后再接種于0.05% Shieh瓊脂培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)16～18 h；用無菌生理鹽水輕輕洗下菌苔，加0.4%甲醛溶液 28 ℃滅活48 h。在此過程中每隔2 h搖勻1次，滅活完畢進行無菌檢驗，再用麥氏比濁管進行計數(shù)，將菌液調成濃度1×107～1×108cfu/mL。用超細勻漿機以12 000 r/min攪拌佐劑的同時緩慢加入等量滅活分離菌菌液抗原，待抗原加完后再以 8 000 r/min高速混合2 min。在溶液乳化過程中，以滴在水面上呈油包水狀為乳化完全，制成油佐劑疫苗，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2無菌檢測：將制備好的免疫原油佐劑滅活疫苗接種于0.05% Shieh瓊脂培養(yǎng)基，置恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)36～48 h，觀察結果。

1.2.2.3動物安全性檢測：選取健康ICR雌性性成熟小鼠15只，其中5只采用灌服免疫原油佐劑滅活疫苗0.3 mL/只，5只采用肌肉注射0.2 mL/只，5只作為對照組。臨床觀察小鼠有無異常，72 h后剖檢。

1.2.3蛋雞的免疫：選擇120日齡純種健康桃源蛋雞10只，分成2組。試驗組7只，將分離菌滅活油佐劑苗經雞翼多點注射。首免采用福氏完全佐劑苗0.5 mL/只進行基礎免疫，在首免后的第14 d采用福氏不完全佐劑苗1 mL/只加強免疫1次，第28 d不加佐劑直接 1.5 mL/只進行加強免疫1次。從第7 d開始收集免疫雞雞蛋，編號記錄后4 ℃保存。對照組3只，不注射免疫原，僅注射PBS乳化劑。

1.2.4IgY的提?。菏占迈r的免疫雞雞蛋，用清水洗凈蛋殼表面的污物，再浸泡于75%酒精消毒15 min。在超凈工作臺內破蛋殼，然后用自制的卵黃分離器去除蛋白，將卵黃置于無菌濾紙上吸干殘余的蛋白，無菌收集卵黃倒入量筒中。再用無菌蒸餾水稀釋卵黃，調節(jié)稀釋液的pH值到微酸性，用玻棒攪拌20 min，置4 ℃自然沉淀4 h，12 000 r/min低溫離心25 min去除脂類，收集上清即為卵黃水溶性組分。將分離的卵黃水溶性組分與等量0.01 mol/L、pH 7.2的PBS混勻，再加4倍體積的脫脂溶液[8](含0.06%卡拉膠，0.18%低甲氧基果膠，10 μmol/L氯化鈣)混勻，12 000 r/min、4 ℃離心25 min，棄沉淀取上清；上清再加硫酸銨至終濃度33%(W/V)，混勻，置4 ℃ 1 h，12 000 r/min離心25 min，棄上清取沉淀用PBS溶解，加入硫酸銨至終濃度20%(W/V)，4 ℃ 過夜，12 000 r/min離心25 min，棄上清取沉淀用PBS溶解，得IgY溶液。提純的IgY樣本在12% SDS-PAGE電泳上分離，20 μL/孔加樣，考馬斯亮藍R-250染色2 h。脫色直到蛋白條帶清晰，凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.2.5間接ELISA方法的建立

1.2.5.1抗原和抗體最佳工作濃度確定：將分離菌1×109cfu/mL用包被液( 0.05 mol/L、pH 9.6)做系列稀釋(1∶50，1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶ 1 600)，縱向包被酶標板，每個濃度包被12個孔，100 μL/孔4 ℃包被過夜。棄去包被液，洗板3次后加入2%BSA封閉液150 μL/孔，37 ℃溫育60 min；棄去封閉液，洗板3次，將純化IgY用抗體稀釋液配成10 mg/mL的工作液，將其倍比稀釋(1∶ 32，1∶ 64，1∶ 128，1∶ 256，1∶ 512，1∶ 1 024)后分別加入酶標板中，橫向100 μL/孔，37 ℃溫育120 min；棄一抗并洗板3次，加入辣根過氧化物酶(HRP)標兔抗雞IgY，1∶ 4 000 稀釋100 μL/孔，37 ℃溫育60 min；棄二抗并洗板3次，加入TMB顯色液100 μL /孔，避光顯色20 min。2 mol/L H2SO450 μL/孔終止反應，用酶標儀測定D450 nm值。結果判定：取陽性值在1.000左右，且相鄰孔的D450 nm值變化較大。其所對應的陰性值小于0.2，且P/N值最大的孔，此孔所對應抗原和抗體的濃度即為抗原包被最佳濃度和抗體最佳工作濃度。

1.2.5.2HRP標記兔抗雞IgY工作濃度確定：根據(jù)以上試驗結果確定抗原的包被濃度，再將純化的IgY按以上梯度稀釋，100 μL/孔縱向加；HRP標記兔抗雞IgY稀釋倍數(shù)為1∶2 000，1∶4 000，1∶6 000，1∶8 000，將其100 μL/孔橫向加，溫育時間、操作步驟及結果判定同1.2.5.1。

1.2.5.3實驗條件的優(yōu)化：封閉30、60、90、120 min；一抗30、60、90 min；二抗30、45、60、90 min；底物顯色10、15、20、30 min；取陽性值在1.000左右，比較P/N值，篩選最佳反應時間。

1.2.6間接ELISA方法的敏感性：將1×109cfu/mL濃度的分離菌用包被液依次稀釋成1×109、1×108、1×107、1×106、1×105cfu/mL 5個濃度梯度，100 μL/孔，4 ℃包被過夜。在以上確定的各個最佳條件下進行間接ELISA實驗操作，以確定檢測分離菌純培養(yǎng)液的檢出限值。

1.2.7間接ELISA方法的特異性：利用建立的間接ELISA方法檢測分離菌和常見的淡水魚致病菌(嗜水氣單胞菌、哈維氏菌)。

1.2.8間接ELISA方法的重復性：檢測建立的間接ELISA反應方法的批內重復性和批間重復性，實驗過程中采集5份卵黃抗體分別經同一批次制備的酶標板和不同批次制備的酶標板進行重復性反應測定。

2 結果

2.1 分離菌鑒定結果分離菌在Shieh瓊脂培養(yǎng)基上形成的菌落最初與培養(yǎng)基的顏色相近，隨著培養(yǎng)時間的延長逐漸變?yōu)榈S色的、假根狀、邊緣不整齊、中央較厚的菌落(見圖1)。生化檢測試驗結果顯示，分離菌對過氧化氫酶反應陽性，七葉苷反應陽性，不水解酪氨酸，不產生吲哚，不能發(fā)酵和利用葡萄糖，鑒定為柱狀黃桿菌(命名為FC-3株)。人工回歸感染草魚試驗結果表現(xiàn)致病性，并從感染后的病魚鰓部再次分離到原感染菌，未分離到其他細菌，菌落形態(tài)及生化試驗結果與菌株FC-3一致。

圖1 分離菌FC-3的菌落形態(tài)

2.2 免疫原油佐劑滅活疫苗無菌檢測結果將制備的免疫原油佐劑滅活疫苗接種于0.05% Shieh固體培養(yǎng)基中，置恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)36～48 h，結果無細菌生長，說明滅活完全。

2.3 免疫原油佐劑滅活疫苗動物安全性檢測結果免疫原油佐劑滅活疫苗分別灌服、肌注ICR雌性小鼠，經72 h臨床觀察，實驗小鼠和對照小鼠無差別，剖檢內臟器官未見任何變化，判為安全。

2.4IgY提取結果分別在初免后，收集第7 d、第14 d、第28 d的IgY，經硫酸銨溶液分級鹽析、透析后，經12% SDS-PAGE電泳分離，結果顯示初步提純后的IgY有2條蛋白條帶，即60 ku左右的重鏈，25～30 ku的輕鏈(見圖2)。

2.5 間接ELISA方法的確立

2.5.1抗原及一抗工作濃度的篩選結果：由表1可見，抗原包被濃度為1∶ 100，抗體稀釋度為1∶ 512時，D450 nm值接近1，且P/N值較大。

2.5.2酶標二抗工作濃度的確定：由表2可見，酶標二抗在1∶ 4 000倍稀釋，一抗在1∶ 512倍稀釋時，D450 nm值接近1，且P/N較大。

圖2 提取IgY的SDS-PAGE電泳M:標準Marker； 1:第28 d IgY； 2:第14 d IgY； 3:第7 d IgY

表1 抗原最佳包被濃度及一抗工作濃度的篩選

表2 一抗及酶標二抗工作濃度的確定

2.5.3試驗條件的優(yōu)化結果：經2%BSA封閉30 min，P值在1.000左右，且P/N較大。一抗和二抗平最佳反應時間分別為60 min和45 min。最佳顯色時間為室溫20 min。見表3、表4、表5。

表3 封閉時間的確定

表4 一抗和二抗最佳反應時間的篩選

表5 最佳顯色時間的確定

2.6間接ELISA的敏感性檢測結果：本實驗設計了5個濃度梯度的柱狀黃桿菌包被液抗原，根據(jù)建立的間接ELISA最佳反應條件下測定各濃度菌液抗原的反應。結果檢測出所制備的IgY對柱狀黃桿菌的純培養(yǎng)液的檢出限值為1×107cfu/mL。見表6。

表6 間接ELISA的敏感性試驗

2.7間接ELISA的特異性檢測結果：用建立的間接ELISA方法檢測柱狀黃桿菌及常見的淡水魚致病菌嗜水氣單胞菌、哈維氏菌。結果柱狀黃桿菌呈明顯陽性反應，嗜水氣單胞菌、哈維氏菌均呈陰性反應，說明本方法對柱狀黃桿菌具有明顯的檢測特異性，對檢測的其他菌株無交叉反應。見表7。

表7 間接ELISA的特異性試驗

2.8重復性試驗結果：經統(tǒng)計學分析，隨機采集的5份IgY分別經同一批次和不同批次制備的酶標板檢測，結果變異系數(shù)均小于10%，表明其反應的重復性好。見表8。

表8 間接ELISA的批內、批間重復試驗

3 結論與討論

3.1柱狀黃桿菌是草魚等魚類爛鰓病的病原，全球每年由于感染這些致病菌引起魚類發(fā)病死亡所造成的經濟損失極其嚴重。目前各類抗生素藥物常被用于控制致病菌引起的疾病，然而化學藥物容易導致病原菌的耐藥性增強和藥物殘留，影響水產品安全且可能導致水環(huán)境受污染[9]。本研究從患典型爛鰓病草魚爛鰓中分離到1株細菌，經生化檢測鑒定為柱狀黃桿菌(FC-3株)，攻毒試驗表明其具有致病性。

3.2IgY的制備及應用是近年來迅速發(fā)展的技術，因其具有特異性、針對性、無耐藥性、安全、制備簡單且無殘留等優(yōu)點，已成為水產免疫學研究的熱點。本研究采用0.4%甲醛滅活處理分離的柱狀黃桿菌制備安全油佐劑滅活疫苗，經免疫健康120日齡桃源蛋雞，制備柱狀黃桿菌卵黃抗體IgY。經硫酸銨分級初步純化，12% SDS-PAGE電泳分離初步提純后的IgY，可見主要有2條蛋白條帶，即60 ku左右的重鏈，25～30 ku的輕鏈。另外，電泳后還有1條電泳條帶。說明通過全菌抗原免疫所得的IgY為多克隆抗體，是多種結構略有差異的抗體組分混合物，所以會出現(xiàn)除IgY的重鏈和輕鏈以外的不止1條電泳條帶的結果。

3.3ELISA實驗的關鍵在于抗原與抗體的結合，在反應過程中影響實驗的因素較多，抗原抗體的濃度、溫度及底物的作用時間等都直接影響到ELISA方法的準確性和可靠性。本研究在建立柱狀黃桿菌間接ELISA檢測方法過程中，通過對試驗反應條件的優(yōu)化，以陽性孔吸光值D450 nm接近1，且P/N值較大時為反應最佳條件，依據(jù)此標準測定了抗原稀釋到1∶100，抗體稀釋度為1∶ 512時，P/N值最大。辣根過氧化物酶標記兔抗雞IgY最佳工作濃度為1∶ 4 000。一抗、二抗最佳反應時間分別為60 min和45 min，顯色最佳時間為室溫20 min。測定柱狀黃桿菌純培養(yǎng)液的檢出限值為107cfu/mL。此方法特異性高，僅與柱狀黃桿菌發(fā)生特異性反應，不與其他淡水魚病原菌株發(fā)生交叉反應，重復性好，可用于對柱狀黃桿菌特異性抗體IgY的監(jiān)測。