(貴陽市南明區(qū)動物疫病預防控制中心，貴州 貴陽 550002)

消化系統(tǒng)疾病是犬的多發(fā)病，其中犬結腸炎多因細菌感染、化學刺激、應激反應、結腸黏膜機械性損傷、過食、食物過敏或不耐受等原因造成[1，2]。潰瘍性結腸炎(UC)以結腸的彌漫性黏膜炎癥和潰瘍性病變?yōu)樘攸c，出現腹瀉、便血、黏液增多和腹痛等癥狀，并且緩解與發(fā)作相互交替[3]。PK結腸溶膠囊是大理大學昆蟲生物醫(yī)藥研究院新開發(fā)的1種藥品，主要特點為膠囊在結腸內溶解，直接作用于患處。本試驗制作犬的急性潰瘍性結腸炎模型，綜合評價口服PK結腸溶膠囊的療效，為犬結腸炎的治療探索更安全有效的治療藥物及療效判斷。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試驗動物：健康中華田園犬成年犬16只，體重10～15 kg，雌雄各半。

1.1.2飼養(yǎng)管理：試驗犬在同一棟標準化圈舍內單籠飼養(yǎng)，逐頭稱重并佩戴耳標建立檔案，飼喂相同分量的日糧及水，預飼2周后注射犬英特威寵必威@優(yōu)免康四聯苗(犬瘟熱、傳染性肝炎、細小病毒病、副流感，批號：A507A01)，再次確定健康后進入正式試驗。

1.1.3藥品試劑與實驗儀器：(1)藥品試劑：PK結腸溶膠囊(大理大學昆蟲生物醫(yī)藥研究院惠贈)、淀粉結腸溶膠囊、柳氮磺吡啶結腸溶膠囊、淀粉、乙酸、生理鹽水、復方新潔爾滅消毒液、犬眠寶、75%醫(yī)用酒精、碘酒、EDTA、10%MgSO4。(2)儀器用品：全自動動物血細胞分析儀(Exigo，瑞典，SN-61564)、9215電子內窺鏡、愛德士生化分析儀(IDEXX Vet Test，美國，OK51015)、C-反應蛋白測量儀(USHIO INC Point-reader V，日本，AMD02A)、生物顯微鏡、常規(guī)手術器械及用品、燒杯、量杯、彈簧度盤秤、載玻片、蓋玻片。

1.2 方法

1.2.1分組：試驗犬隨機分為4組(每組4只，雌雄各半)，即陰性藥物組(淀粉結腸溶膠囊1顆/kg)、正常劑量組(PK結腸溶膠囊1顆/kg)、 2倍劑量組(PK結腸溶膠囊2顆/kg)、陽性藥物組(柳氮磺吡啶結腸溶膠囊1顆/kg)。

1.2.2制備動物模型：在造模前 1 d，使用10%MgSO4溶液按照 5 mL/kg體重對所有試驗犬灌腸后，禁食不禁水24 h。造模當日，使用犬眠寶按照 0.15 mL/kg體重對所有實驗犬肌肉注射進行全身麻醉后，參照乙酸誘導潰瘍性結腸炎大鼠實驗制備動物模型方法[4]，用聚乙烯導管自肛門伸入犬結腸 20 cm，緩慢注入7%乙酸溶液灌腸，保持犬頭低尾高的姿態(tài) 15 s，用生理鹽水 50 mL沖洗使乙酸溶液排出。

1.2.3分組給藥：造模后第 1 d，將空腹試驗犬頭部抬高并打開口腔，對準舌根部喂服各試驗藥物。陰性藥物組喂服淀粉結腸溶膠囊 1 顆/kg，正常劑量組喂服PK結腸溶膠囊 1顆/kg，2 倍劑量組喂服PK結腸溶膠囊 2 顆/kg，陽性藥物組喂服柳氮磺吡啶結腸溶膠囊 1 顆/kg。

1.3 實驗室指標測定

1.3.1血樣采集：采血前向集血容器中加入適量EDTA抗凝劑，采集頸靜脈血2 mL，冰箱4 ℃保存，送檢過程避免血樣劇烈震蕩。

1.3.2白細胞總數檢測：使用Exigo全自動動物血細胞分析儀檢測各組給藥后第 1 d、第 4 d、第 7 d 血樣的白細胞總數(WBC)。

1.3.3C-反應蛋白檢測：用USHIO INC Point-reader V(C-反應蛋白測量儀)檢測各組給藥后第 1 d、第4 d、第 7 d 血樣的血清CRP含量。

1.3.4內窺鏡檢查：用內窺鏡在造模前、造模后及給藥后第 1 d、第 4 d、第7 d對試驗犬結腸進行觀察，記錄結腸黏膜潰瘍、潰爛和出血等情況。

2 結果

2.1 制備動物模型實驗結果內窺鏡觀察可見：造模前犬結腸黏膜呈粉紅色，黏膜表面光滑，無病變。造模后犬結腸黏膜充血、水腫，有炎性彌漫性浸潤，腸壁凸凹不平，形成潰瘍面，說明動物模型制備成功。

2.2 實驗室指標測定結果

2.2.1WBC檢測結果：(1)陰性藥物組給藥后第1 d，WBC為(23.825±3.113)×109/L；第 4 d為(24.275±4.182)×109/L；第7 d為(21.075±3.004)×109/L。(2)陽性藥物組給藥后第 1 d，WBC為(23.805±13.831)×109/L；第 4 d為(16.800±4.645)×109/L，恢復到正常范圍(6×109/L～17×109/L)，較正常劑量組差異顯著(P<0.05)；第 7 d為(13.550±2.767)×109/L。(3)正常劑量組給藥后第 1 d，WBC為(24.275±4.920)×109/L；第 4 d 為(21.823±7.889)×109/L；第7 d 為(18.050±0.893)×109/L。(4)2倍劑量組給藥后第 1 d，WBC為(25.000±12.884)×109/L；第 4 d為(11.250±5.540)×109/L，恢復到正常范圍，較正常劑量組差異顯著(P<0.05)；第 7 d為(10.600±2.688)×109/L，較正常劑量組、陽性藥物組差異極顯著(P<0.01)。見表1、圖1。血常規(guī)檢測WBC變化實驗結果經統(tǒng)計學分析后，根據是否存在差異顯著性，可反映藥物是否成功治療潰瘍性結腸炎動物模型的臨床意義。結果表明：2倍劑量PK結腸溶膠囊效果最好。

表1 犬WBC檢測結果 ×109/L

注：各組間肩標不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，字母相同表示差異不顯著(P>0.05)。下同

圖1 犬WBC檢測柱形圖

注：*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)，無標注表示差異不顯著(P>0.05)。下同

2.2.2CRP檢測結果：(1)陰性藥物組給藥后第1 d，CRP為(103.775±16.747)mg/L；第4 d 為(97.600±29.676)mg/L；第7 d為(36.425±8.764)mg/L。(2)陽性藥物組給藥后第 1 d，CRP為(99.125±23.367)mg/L；第4 d 為(67.450±41.758)mg/L；第7 d為(14.500±2.783)mg/L。(3)正常劑量組給藥后第1 d，CRP為(93.575±17.547)mg/L；第4 d 為(60.125±18.164)mg/L；第7 d為(18.450±7.303)mg/L。(4)2 倍劑量組給藥后第 1 d，CRP為(103.675±28.430)mg/L；第4 d為(48.150±19.549)mg/L，較正常劑量組、陽性藥物組差異顯著(P<0.05)；第 7 d為(7.975±2.425)mg/L，恢復到正常范圍(1～10 mg/L)，較正常劑量組差異顯著(P<0.05)。見表2、圖2。CRP的檢測結果對藥物治療犬結腸炎療效的觀察具有臨床意義。CRP在乙酸誘導急性潰瘍性結腸炎發(fā)生時明顯增加，在給藥后第4 d、第7 d 隨炎癥消退而迅速下降。結果表明： 2倍劑量PK結腸溶膠囊效果最好。

表2 犬CRP檢測結果 mg/L

圖2 犬CRP檢測柱形圖

2.3WBC、CRP相關性分析結果各組相關方程式參考價值從高到低排序為：正常劑量組(r=0.998 2)>陰性藥物組(r=0.977 3)>陽性組(r=0.938 5)>2倍劑量組(r=0.924 4)。相關系數r的大小決定了WBC、CRP 2個變量相關的密切程度，當r越接近1時，表示相關的方程式參考價值越高。結果表明：各組WBC和CRP呈正相關，均可作為犬結腸炎存在、嚴重程度、抗炎治療效果的非特異性指標。

2.4 內窺鏡觀察結果

2.4.1給藥后第 1 d：陰性藥物組(見圖3a)結腸黏膜出血、彌漫性充血、色澤鮮紅；陽性藥物組(見圖3b)結腸黏膜屏障受損，組織細胞壞死導致黏膜面變粗糙；正常劑量組(見圖3c)結腸黏膜上形成點狀糜爛和多發(fā)性小潰瘍；2倍劑量組(見圖3d)結腸黏膜局部可見漿液彌漫性浸潤。表明給藥后第 1 d，4組實驗犬療效均不明顯。

2.4.2給藥后第 4 d：陰性藥物組(見圖4a)結腸黏膜水腫和充血依然可見，潰瘍灶邊緣體積基本沒有減小跡象；陽性藥物組(見圖4b)結腸黏膜組織細胞粗糙、壞死，邊緣體積減??；正常劑量組(見圖4c)結腸黏膜水腫緩解，點狀糜爛腸黏膜開始愈合；2 倍劑量組(見圖4d)結腸黏膜局部滲出液體成分被腸黏膜吸收，潰瘍面積和程度大幅減輕，但炎灶瘢痕邊緣分界仍明顯可見。表明給藥后第 4 d，4組實驗犬療效最好的是2倍劑量組，正常劑量組和陽性藥物組腸黏膜愈合程度大體一致。

a.陰性藥物組 b.陽性藥物組 c.正常劑量組 d.2倍劑量組圖3 給藥后第1 d結腸內窺鏡檢查結果

a.陰性藥物組 b.陽性藥物組 c.正常劑量組 d.2倍劑量組 圖4 給藥后第4 d結腸內窺鏡檢查結果

2.4.3給藥后第 7 d：陰性藥物組(見圖5a)結腸黏膜出血水腫情況有所減輕；陽性藥物組(見圖5b)及正常劑量組(見圖5c)結腸黏膜糜爛和潰瘍灶已經完成組織細胞修復，依稀可見留下的痕跡；2倍劑量組(見圖5d)結腸黏膜色澤基本恢復正常，肉眼觀察無明顯病灶。表明給藥后第7 d，4組實驗犬療效最好的是2倍劑量組，正常劑量組略好于陽性藥物組。

a.陰性藥物組 b.陽性藥物組 c.正常劑量組 d.2倍劑量組圖5 給藥后第7 d結腸內窺鏡檢查結果

3 討論

3.1 乙酸致犬潰瘍性結腸炎模型的制備本實驗參考腸腔灌注法制作乙酸致犬急性潰瘍性結腸炎動物模型，是目前實驗性UC模型中應用最廣泛的模型之一，遵循了模型容易制備并且可以重復以及模型在病理上能反映疾病兩大要點。由于乙酸溶液的化學刺激，作為病理學致炎因子引起炎性充血和刺激性充血，發(fā)生充血的腸黏膜色澤鮮紅，炎灶邊緣體積輕度增大。因小血管壁的通透性增高，炎灶內的微量液體成分通過血管基底膜緩慢滲出在腸黏膜上或者彌漫性浸潤于腸黏膜上，可見漿液，局部炎性水腫并發(fā)生腸黏膜屏障受損、組織細胞壞死，形成潰瘍面。參考夏冰等[5]的研究，前期準備實驗中曾經試用4%、7%、10%乙酸溶液等不同濃度的實驗試劑造模，從腸內壁黏膜損傷情況是否容易觀察、能否有效指向研究目的等方面考慮，最終選擇7%乙酸溶液制備結腸炎臨床病例模型后，由胃腸鏡從肛門深入結腸，發(fā)現結腸炎癥程度隨乙酸濃度增加而加重，而7%乙酸溶液既可導致犬結腸炎，又不致炎癥太重，前期試驗結果符合夏冰等提出的最佳致炎濃度4%～8%的結論。

3.2CRP與犬的急性潰瘍性結腸炎C-反應蛋白(C-reactive protein ，CRP)是1930年由Tillett首先在急性大葉性肺炎患者血清中所發(fā)現的1種蛋白質，它在Ca2+存在下，同肺炎鏈球菌細胞壁上的 C多糖能飽和地結合在一起，發(fā)生沉淀反應，故命名CRP。CRP是急性炎癥或組織嚴重損傷時出現的1種異常蛋白質，在急性炎癥時數小時內明顯增加，1～3 d可達到最高值(增加100～3 000倍)，故又稱為“急性期蛋白”。本實驗取犬頸靜脈血，用C-反應蛋白測量儀分別檢查給藥后第1 d、第4 d、第7 d采集血樣的血清CRP含量，結果表明：陰性藥物組、正常劑量組、2倍劑量組、陽性藥物組CRP在乙酸誘導急性潰瘍性結腸炎發(fā)生時明顯增加，在給藥后第4 d及第7 d隨炎癥消退而迅速下降。在給藥后第1 d、第4 d、第7 d分別以內窺鏡觀察腸道炎癥的范圍與程度，記錄炎癥發(fā)生后腸黏膜潰瘍的整個愈合過程，除陰性藥物組外，其他3組實驗犬急性潰瘍性結腸炎疾病經過的內窺鏡觀察結果和實驗室檢測血清中CRP數據變化情況一致。CRP檢測結果快，操作更簡單，實驗數據真實可靠，能真實反映犬結腸炎臨床癥狀的變化。CRP的檢測已經在人醫(yī)的臨床廣泛應用，包括急性感染性疾病的診斷和鑒別診斷、手術后感染的監(jiān)測、抗生素療效的觀察、病程檢測及預后判斷等[6]。故認為本實驗中CRP結果可以作為犬結腸炎存在、嚴重程度、抗炎治療效果的非特異性指標之一。

3.3 內窺鏡對犬結腸炎臨床診斷的臨床意義結腸鏡的適應癥包括：原因不明的便血或者糞潛血陽性；臨床疑為結腸腫瘤；結腸疑有息肉，或者X射線檢測發(fā)現息肉需要鑒別良性或惡性者；各種原因的腹瀉、疑有潰瘍性結腸炎、克羅恩病或者慢性痢疾，慢性結腸炎者；結腸手術后的復查及術前確定病變范圍者。只要臨床出現便血或者糞潛血陽性而原因不明時，就是結腸鏡檢查的適應癥[7]。2012年廣州炎癥性腸病診斷與治療的共識意見正式明確了結腸鏡檢查并活檢是潰瘍性結腸炎診斷的主要依據[8]。由于犬潰瘍性結腸炎的癥狀主要發(fā)生在黏膜當中的彌漫性黏膜炎癥和潰瘍性病變，最主要的癥狀包括腹瀉、結腸直腸出血、黏液增多和腹痛。對犬的結腸炎臨床診斷時，利用內窺鏡從肛門深入結腸即可直接觀察到結腸黏膜表面的組織變化。本實驗是否成功建立乙酸誘導潰瘍性結腸炎臨床動物模型病例、口服給藥后各組實驗犬結腸黏膜的愈合情況以及對PK結腸溶膠囊治療犬結腸炎的療效評價都與內窺鏡觀察結果密切相關，且在實驗過程中能通過內窺鏡對病變部位取活檢病理學檢查，對于提高動物臨床確診率具有很大的意義。

3.4PK結腸溶膠囊治療犬結腸炎的療效

3.4.1造模給藥后第4 d內窺鏡觀察：2倍劑量組腸炎灶內滲出的液體成分被腸黏膜吸收，潰瘍面積和程度大幅減輕，但炎灶瘢痕邊緣分界仍明顯可見。通過血常規(guī)檢查：2倍劑量組WBC恢復到正常范圍，較正常劑量組差異顯著(P<0.05)；CRP下降幅度為53.56%，較正常劑量組、陽性藥物組差異顯著(P<0.05)。說明對于犬結腸炎的臨床治療，PK結腸溶膠囊2倍劑量組治療效果更優(yōu)于正常劑量組。

3.4.2造模給藥后第7 d內窺鏡觀察：2倍劑量組結腸黏膜已恢復到動物健康時粉色帶正常光澤。血常規(guī)檢查：2 倍劑量組WBC恢復正常，較正常劑量組、陽性藥物組差異極顯著(P<0.01)；CRP也恢復到正常范圍，較正常劑量組差異顯著(P<0.05)，而陽性藥物組CRP尚未恢復正常。說明PK結腸溶膠囊治療犬急性潰瘍性結腸炎效果優(yōu)于柳氮磺吡啶結腸溶膠囊。

4 結論

4.1口服PK結腸溶膠囊治療犬急性潰瘍性結腸炎，治療期間CRP和WBC都顯著下降，2者呈正相關關系。

4.2CRP檢測結果可作為結腸炎存在、嚴重程度、抗炎治療效果的非特異性指標。

4.3PK結腸溶膠囊以 2顆/kg劑量治療犬結腸炎療效明顯，其效果優(yōu)于1顆/kg的正常劑量和柳氮磺吡啶。