沈靜琳， 丁 瑩

（1.江西醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校藥學(xué)系，江西 上饒334000；2. 廣東藥科大學(xué)醫(yī)藥化工學(xué)院，廣東 中山528458）

養(yǎng)陰鎮(zhèn)靜片收載于《中藥成方制劑制劑（第二冊(cè)） 》［1］，由麥冬、地黃、茯苓、丹參等14 味藥材加工而成，具有滋陰養(yǎng)血、鎮(zhèn)驚安神的療效，臨床上用于心血不足、怔神健忘、心煩不安、心悸失眠等病癥，方中地黃、玄參、麥冬、五味子滋陰生津潤(rùn)燥，為君藥；附以茯苓、丹參、柏子仁、遠(yuǎn)志、首烏藤養(yǎng)心安神定驚，當(dāng)歸、黨參氣血調(diào)補(bǔ)，珍珠母、朱砂平肝潛陽(yáng)，桔梗宣肺利咽，共奏補(bǔ)血養(yǎng)心、滋陰降火、鎮(zhèn)驚安神之效?，F(xiàn)代研究表明，養(yǎng)陰鎮(zhèn)靜片具有中樞抑制作用，對(duì)更年期失眠癥、陰虛火旺引起的神經(jīng)衰弱等病癥療效顯著［2-4］，但現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)未對(duì)方中任何成分進(jìn)行含有量測(cè)定，文獻(xiàn)［5］ 也僅針對(duì)了阿魏酸。

為了全面有效地控制養(yǎng)陰鎮(zhèn)靜片質(zhì)量，確保有效性，本實(shí)驗(yàn)參考中藥質(zhì)量標(biāo)志物確定原則［6-7］，根據(jù)中藥制劑在中醫(yī)理論指導(dǎo)下組方配伍的原理，結(jié)合君藥為主，臣、佐、使兼顧的原則，選擇主要藥材麥冬、地黃、茯苓、丹參作為研究對(duì)象，以丹參酮ⅡA為內(nèi)標(biāo)，采用一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定麥冬甲基黃烷酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B、梓醇、去氫土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸、丹參素、丹參酮ⅡA的含有量，為該制劑質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

Waters 2695 型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；AL204 型電子天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）；KQ-250E 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。養(yǎng)陰鎮(zhèn)靜片 （每片重0.3 g， 批號(hào)20170403、20170901、20180101） 購(gòu)自吉林亞泰明星制藥有限公司。梓醇（110808-201711）、丹參酮ⅡA（110766-201721） 對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；麥冬甲基黃烷酮A（74805-92-8）、甲基麥冬二氫高異黃酮B（74805-91-7）對(duì)照品購(gòu)自江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司；去氫土莫酸（6754-16-1）、去氫茯苓酸（77012-31-8） 對(duì)照品購(gòu)自南京森貝伽生物科技有限公司；茯苓酸（29070-92-6）、丹參素（22681-72-7）對(duì)照品購(gòu)自上海純優(yōu)生物科技有限公司。乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Hypersil ODS-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流動(dòng)相乙腈（A） -0.1%磷酸（B）， 梯 度 洗 脫 （0 ～15 min， 26.0%A； 15 ～23 min，26.0%→38.0%A；23 ～31 min，38.0%→42.0%A；31 ～49 min，42.0%→77.0%A；49 ～63 min，77.0%→85.0%A；63 ～70 min，85.0%→26.0%A）；0～23 min 時(shí)在296 nm［8］波長(zhǎng)下檢測(cè)麥冬甲基黃烷酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B，23 ～49 min 時(shí)在210 nm［9-13］波長(zhǎng)下檢測(cè)梓醇、去氫土莫酸、去氫茯苓酸、 茯苓酸， 49 ～70 min 時(shí) 在280 nm［14-15］波長(zhǎng)下檢測(cè)丹參素、丹參酮ⅡA；體積流量0.8 mL／min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取麥冬甲基黃烷酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B、梓醇、去氫土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸、丹參素、丹參酮ⅡA對(duì)照品適量，70%甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.212、0.196、0.978、0.534、0.306、0.622、0.718、1.294 mg／mL的貯備液，分別精密吸取2.5 mL 置于同一50 mL量瓶中，70%甲醇稀釋至刻度，制成質(zhì)量濃度分別為10.6、 9.8、 48.9、 26.7、 15.3、 31.1、 35.9、64.7 μg／mL 的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 取片劑適量，除去糖衣，研成細(xì)粉，混勻，精密稱取3.0 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入25 mL 70%甲醇，稱定質(zhì)量，超聲提?。?50 W、40 kHz） 30 min，擦干外壁，放冷，70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按片劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下的處方和制法，分別制備不含麥冬、地黃、茯苓、丹參的陰性樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)與專屬性考察 精密吸取“2.2.1” ～ “2.2.3” 項(xiàng)下供試品、對(duì)照品、陰性樣品溶液適量，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見圖1。由圖可知，各成分與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)按各成分計(jì)均不低于4 000。

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.1” 項(xiàng)下貯備液適量，70%甲醇分別制成6 個(gè)20 倍質(zhì)量濃度差的線性溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取“2.2.1” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得麥冬甲基黃烷酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B、梓醇、去氫土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸、丹參素、丹參酮ⅡA峰面積RSD 分別為1.15%、1.09%、0.70%、0.89%、0.95%、0.84%、0.76%、0.57%，表明儀器精密度良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批片劑6 份， 按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得麥冬甲基黃烷酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B、梓醇、去氫土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸、丹參素、丹參酮ⅡA含有量RSD分別為1.82%、0.97%、1.38%、0.75%、1.63%、1.72%、0.39%、1.44%，表明該方法重復(fù)性良好。2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，室溫下于0、2、4、8、12、16 h 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得麥冬甲基黃烷酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B、梓醇、去氫土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸、丹參素、丹參酮ⅡA峰面積RSD 分別為1.17%、1.19%、0.66%、0.89%、0.90%、0.87%、1.74%、0.59%，表明溶液在16 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 取含有量已知的片劑（批號(hào)20170403），除去糖衣，研成細(xì)粉，混勻，精密稱取6 份，每份約1.5 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入對(duì)照品溶液（0.137 mg／mL 麥冬甲基黃烷酮A、0.104 mg／mL 甲基麥冬二氫高異黃酮B、0.711 mg／mL 梓醇、0.339 mg／mL 去氫土莫酸、0.231 mg／mL 去氫茯苓酸、0.416 mg／mL 茯苓酸、0.479 mg／mL 丹參素、0.994 mg／mL 丹參酮ⅡA）各1.0 mL，按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，麥冬甲基黃烷酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B、梓醇、去氫土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸、丹參素、丹參酮ⅡA的平均加樣回收率（RSD）分 別 為 98.08% （1.17%）、 96.89% （1.34%）、99.03% （0.84%）、 98.49% （1.14%）、 97.91%（1.25%）、99.21% （1.06%）、99.60% （0.83%）、100.05% （0.60%）。

2.4 相對(duì)校正因子計(jì)算 精密吸取“2.3.2” 項(xiàng)下線性溶液適量，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，以丹參酮ⅡA為內(nèi)標(biāo)，計(jì)算其他7 種成分的相對(duì)校正因子fk／s， 公式為fk／s=fk／fs= （WkAs） ／（WsAk） （Wk為其他成分質(zhì)量濃度，Ak為其他成分峰面積，Ws為內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度，As為內(nèi)標(biāo)峰面積），結(jié)果見表2。

表2 各成分相對(duì)校正因子Tab.2 Relative correction factors of various constituents

2.5 相對(duì)校正因子重復(fù)性試驗(yàn) 精密吸取“2.2.1” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，考察Waters 2695、LC-2010 色譜儀和Hypersil ODS-C18、Agilent Zorbax SB C18、Diamonsil C18色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果見表3，可知均無明顯影響。

表3 不同儀器、色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響Tab.3 Effects of different instruments and columns on relative correction factors

2.6 色譜峰定位 以丹參酮ⅡA為內(nèi)標(biāo)，采用相對(duì)保留值法考察其他7 種成分在不同色譜儀、色譜柱下與內(nèi)標(biāo)的相對(duì)保留值，結(jié)果見表4，可知均無明顯影響。

表4 各成分相對(duì)保留值Tab.4 Relative retention values of various constituents

2.7 樣品含有量測(cè)定 取3 批片劑 （批號(hào)20170403、 20170901、 20180101）， 按 “2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，分別采用外標(biāo)法和一測(cè)多評(píng)法計(jì)算含有量，結(jié)果見表5，可知2 種方法無明顯差異，相對(duì)平均偏差（RAD） 均＜2.0%。

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法選擇 本實(shí)驗(yàn)首先考察了50%甲醇、70%甲醇［14］、甲醇［8-13，16］對(duì)養(yǎng)陰鎮(zhèn)靜片中麥冬甲基黃烷酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B、梓醇、去氫土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸、丹參素、丹參酮ⅡA綜合提取效率的影響，發(fā)現(xiàn)以70%甲醇為溶劑時(shí)效果優(yōu)于50%甲醇（去氫土莫酸、丹參酮ⅡA提取率較低）、甲醇（丹參素提取率較低）。然后，考察了提取方法（超聲［8-14］、加熱 回 流［9］） 和 提 取 時(shí) 間 （15、 30［9-12］、45 min［8，15-16］），發(fā)現(xiàn)2 種方法提取30、45 min 對(duì)各成分提取率影響相當(dāng)，均明顯高于提取15 min時(shí)的去氫土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸，可能與養(yǎng)陰鎮(zhèn)靜片制備工藝中茯苓粉碎后以細(xì)粉入藥，麥冬、地黃、丹參提取后入藥有關(guān)。綜合以上結(jié)果，同時(shí)考慮操作便捷性和可重復(fù)性，確定70%甲醇超聲30 min 作為供試品溶液制備方法。

表5 各成分含有量測(cè)定結(jié)果（mg／g，n=3）Tab.5 Results of content determination of various constituents（mg／g，n=3）

3.2 流動(dòng)相體系選擇 本實(shí)驗(yàn)首先考察了甲醇-水、乙腈-水［8，16］，發(fā)現(xiàn)后者洗脫能力強(qiáng)，分離速度較快，但茯苓酸、去氫茯苓酸色譜峰存在拖尾現(xiàn)象，梓醇色譜峰與雜質(zhì)峰之間的分離度不理想。在此基礎(chǔ)上，又考察了乙腈-0.05%磷酸［12-13］、乙腈-0.1%磷酸［9-10］、乙腈-0.2%磷酸體系，最終選擇乙腈-0.1%磷酸作為流動(dòng)相。

4 結(jié)論

近年來，多指標(biāo)成分定量控制已成為中成藥復(fù)方制劑質(zhì)量評(píng)價(jià)的發(fā)展趨勢(shì)，一測(cè)多評(píng)法利用中藥有效成分之間存在的內(nèi)在函數(shù)和比例關(guān)系，通過測(cè)定其中1 種質(zhì)量穩(wěn)定、對(duì)照品易得成分來實(shí)現(xiàn)多種成分的同時(shí)測(cè)定，有效解決了相關(guān)分析中對(duì)照品需求量大、 檢驗(yàn)成本高的弊端， 已得到普遍應(yīng)用［17-18］。本實(shí)驗(yàn)建立一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定養(yǎng)陰鎮(zhèn)靜片中麥冬甲基黃烷酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B、梓醇、去氫土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸、丹參素、丹參酮ⅡA的含有量，發(fā)現(xiàn)該方法穩(wěn)定可靠，所得結(jié)果與外標(biāo)法接近，可為該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)全面提高和有效評(píng)價(jià)提供有力的數(shù)據(jù)支持。