饒 穎， 黃文平， 馮育林，3， 歐陽 輝，3， 楊世林，，3?

（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅蘭州730000；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心，江西 南昌330006；3.創(chuàng)新藥物與高效節(jié)能降耗制藥設(shè)備國家重點實驗室，江西 南昌330006）

玳玳花為蕓香科植物玳玳花Citrus aurantium L. var.amara Engl 的花蕾，亦叫枳殼花、酸橙花；大多數(shù)分布于長江以南如江蘇、浙江、廣東等地區(qū)，曾收載于1977版《中國藥典》 及 《福建省中藥材標準》［1-2］。 據(jù)文獻記載，玳玳花有調(diào)氣疏肝、 理氣寬胸、 開胃止嘔等功效，現(xiàn)代藥理研究表明其具有抗炎、抗氧化、改善免疫及抗肝損傷等作用［3-5］，亦有江蘇、浙江等地民間多于立夏前后，摘取含苞待放的花朵， 用微火烘干， 代茶飲，有藥食同源之功效［6-8］。而目前，對玳玳花的化學(xué)成分開發(fā)研究鮮見報道，為明確其化學(xué)成分，為闡釋該藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機制提供依據(jù)， 本實驗運用UPLC-QTOF-MS／MS 技術(shù)，對玳玳花的化學(xué)成分進行定性研究。該方法簡單快捷， 避免粗提、 純化的繁瑣過程，可用于玳玳花的質(zhì)量控制。

1 材料

島津LC-30 A 超高效液相色譜儀，包含在線脫氣機、高壓二元泵、自動進樣器、柱溫箱 （日本島津公司）；Triple-TOF 5600+高分辨質(zhì)譜儀，配備ESI 離子源及Analyst 1.6 數(shù)據(jù)處理軟件、Peak View 數(shù)據(jù)處理軟件（美國AB Sciex 公司）；HC-3018R 型高速冷凍離心機（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；Millipore-Simplicity 超純水處理系統(tǒng)（德國默克密理博公司），KQ-400DB 型超聲清洗機（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）， AL204 型電子分析天平［Mettler Toledo 儀器（上海） 有限公司］。

對照品秦皮乙素（批號110741-201708）、咖啡酸（批號110885-201703）、異葒草素（批號140926-201109）、槲皮苷（批號111538-201606）、山柰酚-3-O-蕓香糖苷（批號112007-201602）、蕓香柚皮苷（批號110722-201714）、柚皮苷（批號110722-201714）、3，5-二咖啡?？鼘幩幔ㄅ?11782-201706）、4，5-二咖啡?？鼘幩?（批號111894-201102）、新橙皮苷（批號110721-201617）、橙皮苷（批號110721-201617）、 山 柰 酚 （110861-201611）、 槲 皮 素（批號100081-201610）、芹菜素（批號111901-201603）、大黃酸（批號110757-201607）、銀杏內(nèi)酯A（批號110862-201612），均購于中國食品藥品檢定研究院?？鼘幩幔ㄅ朆CTG-170303）、白蠟樹苷（批號BCTG-160512）、二氫咖啡酸 （批號BCTG-160402）、隱綠原酸 （批號BCTG-170407）、3，4-二咖啡?？鼘幩幔ㄅ朆CTG-150201）、4-羥基肉桂酸 （批號BCTG-150803）、異夏佛托苷 （批號BCTG-160702）、木 犀 草 素-7-O-葡 萄 糖 苷 （批 號BCTG-160723）、蝶豆寧 （批號BCTG-150323）、圣草酚 （批號BCTG-160213），均購于江西本草天工科技責(zé)任有限公司。玳玳花（浙江嘉興，批號170329）。乙腈、甲酸色為譜純，水為超純水，其余均為分析純。

2 方法

2.1 分析條件

2.1.1 色譜條件 采用Shim-Pack XR C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相0.1% 甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0.01 ～4 min，2%B；4 ～6 min，2%～5%B；6～10 min，5%～10%B；10～20 min，10%～20%B；20～30 min，20%～28%B；30 ～45 min，28%～70%B；45 ～50 min，70%B；50～52 min，70%～2%B；52 ～60 min，2%B）；體積流量0.25 mL／min；柱溫40 ℃；進樣量2.0 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧電離源（ESI），負離子模式；質(zhì)量掃描范圍為m／z 100～1 200；噴霧電壓-4 500 V；霧化氣溫度600 ℃；氣簾氣172.36 kPa；霧化氣和輔助氣344.74 kPa；去簇電壓 （DP）120 V；采用TOF-MS-IDAMS／MS 方法采集數(shù)據(jù)，TOF／MS 一級預(yù)掃描和觸發(fā)的二級掃描TOF／MS／MS 離子累積時間分別為500、200 ms；CE碰撞能量為-38 eV。

2.2 對照品溶液制備 精密取各對照品適量，分別加甲醇配制成0.2 mg／mL 的溶液，備用。

2.3 供試品溶液制備 取玳玳花粉末（過4 號篩）0.3 g，加甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，回流30 min，放冷，過濾，濾液置8 000 r／min離心機中離心，過0.22 μm 濾微孔濾膜，即得。

3 結(jié)果與分析

3.1 化學(xué)成分鑒定 UHPLC-QTOF-MS／MS 法對玳玳花成分進行定性分析，質(zhì)譜總離子流圖見圖1。結(jié)合樣品中各色譜峰的精確質(zhì)量數(shù)、分子式及碎片峰信息，推測了各色譜峰可能的結(jié)構(gòu)。主要色譜峰的保留時間，質(zhì)譜信息，推測的分子式，化合物及其碎片離子歸屬等見表1。

圖1 負離子模式總離子流圖

表1 化學(xué)成分分析

續(xù)表1

續(xù)表1

3.2 成分分析

3.2.1 酚酸類 峰9 的一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)見表1，表明［M-H］離子為m／z179.034 7，Peakview1.2 軟件給出其元素組成（預(yù)測分子式） 為C9H8O4，誤差為-1.4；二級碎片離子峰m／z 為161.029 0，135.045 2，107.049 7，79.056 5；根據(jù)對照品信息比對可以鑒定峰9 為咖啡酸見圖2。在二級質(zhì)譜中，峰9 產(chǎn)生的碎片離子主要為135.045 2，進一步證明峰12 物質(zhì)母核結(jié)構(gòu)上羥基縮合脫水，得到m／z 161.029 0碎片離子，同時側(cè)鏈上失去CO2和苯環(huán)上失去CO，而產(chǎn)生碎片離子135.045 2 和107.049 7。同理［9-12］鑒定了峰4、11 等。

3.2.2 香豆素類 峰8 的主要產(chǎn)生m／z 為177.019 3 的［M-H］離子，二級質(zhì)譜有161.031 5，149.022 5，133.030 3，105.043 0 的碎片離子，主要裂解見圖3；通過對照品信息，推測可能為秦皮乙素。根據(jù)上述裂解途徑，通過相關(guān)文獻［13-15］，同理鑒定了峰23。

3.2.3 黃酮類 峰35 的母離子m／z 609.1854，發(fā)現(xiàn)二級489.142 8，343.082 5，301.071 3，主要裂解見圖4；根據(jù)ChemSpider 數(shù)據(jù)庫及對照品信息，成分鑒定為橙皮苷。根據(jù)上述裂解途徑及相關(guān)文獻［16］，同理鑒定了峰27、29、33、36 等。

3.2.4 其他成分 峰57 的母離子m／z 293.212 2，發(fā)現(xiàn)二級235.169 6，211.133 4，191.180 2，155.106 9，127.119 0，121.101 6，109.064 4，133.058 4，81.037 2，根據(jù)ChemSpider 數(shù)據(jù)庫，推測可能成分為13-HoTrE（r），根據(jù)上述裂解途徑及相關(guān)文獻［17］，同理鑒定了峰55、58。

圖2 咖啡酸裂解途徑

圖3 秦皮乙素裂解途徑

圖4 hesperidin 裂解途徑

4 討論

玳玳花自古以來都是重要的既能治療疾病又能當日常涼茶飲用的藥材，具有多種藥理活性，但其物質(zhì)基礎(chǔ)尚缺少研究。本實驗采用UHPLC-QTOF-MS／MS 聯(lián)用技術(shù)檢測玳玳花中的58 種化學(xué)成分，其分析時間短，溶劑消耗少，分離效果及分析效率大幅度提升；可以提高保留時間重現(xiàn)性及色譜分辨率，有著超高分離度、超高靈敏度的特點。能夠快速對復(fù)雜的化學(xué)成分體系進行分析［20-22］，是目前研究、推測中藥成分的有效手段。

本研究運用UHPLC-QTOF-MS／MS 技術(shù)對玳玳花進行化學(xué)成分分析鑒定尚屬首次，其化學(xué)成分主要為黃酮和酚酸類，多是既能治療疾病又是能提高人體免疫力的基礎(chǔ)物質(zhì)，例如黃酮類的柚皮苷，具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗病毒、抑菌及抑制眼醛糖還原酶的等作用，在臨床上能用于降低血膽固醇、減少血栓的形成，改善局部微循環(huán)和營養(yǎng)供給，亦防治心腦血管等疾?。?3］。山柰酚具有良好的抗菌活性，能有效地抗感染及抑制炎癥因子，臨床上多用來防治糖尿病及動脈粥樣硬化等疾病，均有良好的療效［24］，這些成分都為玳玳花在抗炎、抗氧化、改善免疫及抗肝損傷等作用提供較好的物質(zhì)基礎(chǔ)，以期為玳玳花的質(zhì)量控制指標的選擇及藥效研究提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，并為后續(xù)玳玳花藥理作用研究及其機制研究提供了詳實的數(shù)據(jù)支撐，對其保健開發(fā)及臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。