王永輝，奇錦峰，孫晨

（1. 河南省駐馬店市中心醫(yī)院藥學(xué)部，河南 駐馬店 463000；2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，廣東 廣州 510006）

中藥柴胡為傘形科植物柴胡或狹葉柴胡的干燥根，有解熱抗炎、保肝及免疫調(diào)節(jié)等功效。柴胡皂苷是柴胡的主要成分，目前發(fā)現(xiàn)有柴胡皂苷a、柴胡皂苷b1、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d等[1]。葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶（UGT）和硫酸轉(zhuǎn)移酶（SULT）是Ⅱ相代謝酶的主要成員，對很多藥物的Ⅱ相代謝具有重要的作用[2]。國外有研究發(fā)現(xiàn)十字花科蔬菜（如卷心菜、洋白菜等）中所含的吲哚能增加UGT活性進(jìn)而促進(jìn)奧沙西泮和撲熱息痛的葡萄糖醛酸反應(yīng)[6]。柴胡在國內(nèi)應(yīng)用廣泛，然而柴胡總皂苷對Ⅱ相代謝酶的影響尚無研究報道。本文主要探討柴胡總皂苷（total saikosaponins，TSS）對小鼠UGT1A1和SULT1A1活性及mRNA表達(dá)的影響，為臨床相關(guān)研究或藥物治療提供參考。

1 實驗材料

1.1 動物

NIH小鼠（SPF級），體質(zhì)量18～26g [廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，合格證號SCXK（粵 2008-0020），粵監(jiān)證號：2008A003]。由實驗動物專用飼料喂養(yǎng)。

1.2 試劑

柴胡總皂苷（含量≥85%，昆明科翔生物有限公司）；3’-磷酸腺苷5’-磷酸硫酸（Sigma）；2-萘酚硫酸鹽（Sigma）；4-硝基苯酚硫酸鹽（Sigma）；Brandford 蛋白定量試劑盒（上海杰美基因有限公司）；RT-PCR試劑（TaKaRa公司）。

1.3 儀器

低溫高速離心機(jī)（Thermo 電子公司）；G7-953T型組織勻漿機(jī)（As One，日本）；紫外分光光度計（尤尼柯上海儀器公司）；實時熒光定量PCR儀（ABI7500，USA）；核酸蛋白檢測儀（BIO-RAD Laboratories，USA）。

2 實驗方法

2.1 分組與給藥

將30只小鼠隨機(jī)分為3組，雌雄各半。分別為純水組（10 mL/kg）、柴胡總皂苷（TSS）高、低劑量組（給藥劑量分別為150 mg/kg、50 mg/kg）。連續(xù)灌胃7 d，每天2次。

2.2 肝微粒體和胞質(zhì)液制備

小鼠肝臟微粒體和胞漿液的制備依據(jù)文獻(xiàn)方法進(jìn)行[3]。最終所得肝微粒體用于測定UGT1A1活性，肝胞漿液測定SULT1A1活性。以Bradford法測定胞漿液和微粒體中的蛋白含量。

2.3 小鼠肝臟UGT1A1活性測定

UGT1A1活性測定依據(jù)文獻(xiàn)進(jìn)行[4]，反應(yīng)體系于540 nm處測吸光度值，以苯胺濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線：

2.4 小鼠肝臟SULT1A1活性測定

SULT1A1活性測定參考文獻(xiàn)方法進(jìn)行[5]。以4-硝基酚（或2-萘酚）硫酸鹽濃度值為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得線性回歸方程（線性范圍0.0625～2.5 μmol/mL）：① 4-硝基酚硫酸鹽 ：

② 2-萘酚硫酸鹽：

2.5 實時定量PCR分析

小鼠肝臟總RNA提取和RT-PCR反應(yīng)按試劑盒說明書進(jìn)行。PCR引物根據(jù)文獻(xiàn)[6]設(shè)計（見表1）。PCR反應(yīng)每個樣品進(jìn)行3次重復(fù)實驗，PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s，然后進(jìn)入循環(huán)階段，每個循環(huán)包括95 ℃變性15 s，56 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 31 s，共 40 個循環(huán)。最后以目的基因與GAPDH的含量比值表示目的基因的表達(dá)水平，計算供試物組小鼠與純水組小鼠中目的基因表達(dá)水平的比值。

2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料以“±s”表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 UGT1A1活性測定

柴胡總皂苷高、低劑量組小鼠肝臟UGT1A1活性與純水組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），提示其對小鼠肝臟UGT1A1活性不具有影響。見表2。

表1 實時熒光定量PCR實驗的引物序列

表2 小鼠肝臟UGT1A1活性測定結(jié)果

3.2 SULT1A1活性測定

分別以2-萘酚和4-硝基酚為底物測定小鼠肝臟SULT1A1酶活性，柴胡總皂苷高、低劑量組小鼠SULT1A1活性均高于純水組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 小鼠肝臟SULT1A1 活性測定結(jié)果

3.3 小鼠肝臟UGT1A1 mRNA表達(dá)

UGT1A1基因表達(dá)測定中，柴胡總皂苷高劑量組與純水組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），說明TSS對UGT1A1 mRNA的表達(dá)沒有影響。

圖1 各組小鼠肝臟UGT1A1 mRNA表達(dá)量的比較

3.4 小鼠肝臟SULT1A1 mRNA表達(dá)

SULT1A1基因表達(dá)測定中，柴胡總皂苷高劑量組高于純水組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。說明TSS對SULT1A1 mRNA表達(dá)有明顯的誘導(dǎo)效應(yīng)。

圖2 各組小鼠肝臟SULT1A1 mRNA表達(dá)量的比較

4 討論

UGT1A1在整個UGT家族中具有重要意義，主要參與體內(nèi)膽紅素和部分化合物（酚類、蒽醌類、黃酮類等化合物）的葡萄糖醛酸化反應(yīng)；SULT1A1主要參與酚類化合物如4-硝基酚、2-萘酚、芳香胺等物質(zhì)的硫酸化反應(yīng)。在測定小鼠SULT1A1活性時，本研究分別以4-硝基酚和2-萘酚為底物測定酶活性，使兩種底物的測定結(jié)果相互驗證，增加了檢測結(jié)果的可靠性。雖然柴胡總皂苷對小鼠肝臟UGT1A1活性沒有影響，但對SULT1A1活性的誘導(dǎo)作用、對增加某些藥物的硫酸化反應(yīng)，促進(jìn)其排泄具有積極意義。

本研究證明柴胡總皂苷對小鼠SULT1A1活性和mRNA表達(dá)具有一定的誘導(dǎo)作用，可能促進(jìn)某些藥物在體內(nèi)的硫酸化反應(yīng)，因此在臨床用藥期間應(yīng)重視柴胡總皂苷對其它合用藥物在體內(nèi)代謝的影響，避免藥物之間相互作用。