尹國友 王林嵩

摘要：根據(jù)NCBI上傳的豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）[GenBank：JN547228（CH/S）]，設(shè)計引物對陽性病料進(jìn)行鑒定并回收，與pMD18-T構(gòu)建重組載體并測序。對豬流行性腹瀉病毒的基因多樣性及序列保守性進(jìn)行分析，一是以經(jīng)典毒株為主，包括CV777、KPEDV-9和CH/S株等為代表的G1基因型，另一種是以近幾年分離的毒株為主，包括HB3-CH2012、CXHZ-CH2013、HNCZ-CH2013等為代表的G2基因型。基因同源性分析比較結(jié)果表明，這4株P(guān)EDV之間的序列同源性為97.6%～100.0%，與經(jīng)典株CV777的同源性為92.7%～92.8%。同源分析顯示，PEDV不同毒株間的基因同源性仍高度相似，但PEDV流行毒株已呈現(xiàn)進(jìn)化分支的趨勢。

關(guān)鍵詞：豬流行性腹瀉病毒;S基因;序列分析

中圖分類號：S858.285.3?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）11-0071-03

豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的豬流行性腹瀉病（porcine epidemic diarrhea，PED）是一種高死亡率的腸道傳染病，會在豬群中引起各個年齡段豬暴發(fā)急性腹瀉，多發(fā)于仔豬和胎豬，其臨床癥狀主要以豬水樣腹瀉、嘔吐和脫水為主。1971年，英國首先報道了PEDV的暴發(fā)流行[1]，隨后在比利時、德國、瑞士、日本、韓國等許多養(yǎng)殖大國出現(xiàn)報道[2-3]。1976年，中國大陸首次報道PED的發(fā)生與流行，1984年通過免疫熒光試驗證實病原微生物為豬流行性腹瀉病毒[4]。20世紀(jì)80年代后，我國不斷有PED發(fā)生，其中26個?。ㄊ?、自治區(qū)）都曾發(fā)生。20世紀(jì)90年代后期，豬傳染性胃腸炎（華毒株）和豬流行性腹瀉（CV777）二聯(lián)滅活苗或弱毒苗，在我國開始大范圍使用并取得良好免疫效果[5]。國內(nèi)外對該病的研究和重視程度均遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，我國甚至沒有把豬流行性腹瀉列為國家動物法定傳染病的一、二和三類疫病[6]。自2006年后，以經(jīng)典毒株CV777基礎(chǔ)研制的滅活苗或弱毒苗免疫效果下降，免疫過的豬場還出現(xiàn)多次豬流行性腹瀉病的暴發(fā)。2010年起，豬流性腹瀉病開始在全國大部分的主要養(yǎng)殖區(qū)出現(xiàn)，導(dǎo)致初生仔豬死亡率高達(dá)90%以上，全國仔豬死亡估計有上千萬頭[7-8]，給生豬養(yǎng)殖業(yè)造成了難以估量的經(jīng)濟(jì)損失。

PEDV屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬，其中冠狀病毒屬分為α、β、γ、δ 4個群[9]，豬流行性腹瀉屬于冠狀病毒α群，豬流行性腹瀉基因組是單股正鏈具有感染性的RNA，其基因組大小為28 kb左右，其中S基因編碼的S蛋白是一種跨膜糖蛋白，位于病毒表面。S蛋白與細(xì)胞受體結(jié)合、病毒融合，最重要的是，在誘導(dǎo)中和抗體方面和病毒粒子與細(xì)胞表面受體結(jié)合后通過膜融合侵入宿主細(xì)胞方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[10-11]。通過分析比對豬流行性腹瀉病毒S基因分離株與經(jīng)典株之間核苷酸和氨基酸的同源性、抗原表位差異、糖基化位點(diǎn)及跨膜域差異性，以期為預(yù)防和控制豬流行性腹瀉暴發(fā)流行提供理論數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

Trizol LS Reagent，購自美國Invitrogen公司產(chǎn)品;pMD18-T載體克隆試劑盒、DL 2000 DNA Marker、rTaq酶、RNA酶抑制劑（HPRI）、dNTP、反轉(zhuǎn)錄酶（AMV）、UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒，均購自生工生物工程（上海）有限公司;BamH Ⅰ及Hind Ⅲ限制性內(nèi)切酶，均購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司;DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞由實驗室保存。本研究于2016年在河南城建學(xué)院分子生物學(xué)實驗室完成。

1.2 引物的設(shè)計和合成

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫GenBank中發(fā)表的JN547228基因序列，設(shè)計并合成S基因測序引物，引物序列見表1。

1.3 模板的制備

取來自發(fā)病豬的病變組織細(xì)胞勻漿液，按Trizol LS Reagent使用說明，提取病毒RNA，將提取物RNA置于 -20 ℃ 冰箱保存。

1.4 RT-PCR

將設(shè)計好的下游引物1.0 μL，0.4 μL Rnase-Inhibitor，5.0 μL dNTP，4.0 μL 5×AMV Buffer，1.0 μL AMV，加入 10.0 μL RNA，42 ℃水浴1～2 h，即得cDNA模板，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 目的片段S基因的擴(kuò)增

取cDNA產(chǎn)物1.0 μL作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系：10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP 2.0 μL，rTaq酶0.5 μL，PEDV-S-sense/PEDV-S-anti-sense各0.5 μL，用滅菌ddH2O補(bǔ)足25.0 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性 5 min;94 ℃ 50 s，58 ℃ 50 s，72 ℃ 60 s，共進(jìn)行35個循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增結(jié)果。

1.6 目的基因的克隆及序列測定

將擴(kuò)增的RT-PCR產(chǎn)物，回收產(chǎn)物與載體pMD18-T進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，挑選陽性菌落于100 mL液體LB（含A+）液體培養(yǎng)基中，放置于37 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)過夜，用堿性法提取重組質(zhì)粒。并用雙酶切酶BamHⅠ、HindⅢ酶切重組質(zhì)粒，陽性質(zhì)粒進(jìn)行測序。

1.7 基因序列分析

利用Clustal 1.83和MEGA 5.05軟件對豬流行性腹瀉病毒的基因多樣性及序列保守性分析，繪制毒株的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的擴(kuò)增

RT-PCR擴(kuò)增毒株，顯示與預(yù)期片段1 058 bp相似大小的特異片段（圖1）。

2.2 組質(zhì)粒的酶切鑒定

用BamHⅠ、HindⅢ限制性內(nèi)切酶對重組質(zhì)粒pMD18-PEDV-S進(jìn)行雙酶切鑒定，將酶切產(chǎn)物用凝膠核酸電泳得到預(yù)期大小約1 058 bp和2 000 bp以上的2條電泳條帶（圖2）。

2.3 DNA序列測定

酶切鑒定陽性pMD18-PEDV-S克隆質(zhì)粒送上海生工生物工程有限公司測序，將測序序列通過Blast雙重比對，分析表明pMD18載體已插入PEDV-S基因。

2.4 氨基酸的序列多樣性、同源性分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載經(jīng)發(fā)表的20株國內(nèi)外毒株序列，與4個分離株（PEDV-HN1、PEDV-HN2、PEDV-HN3、PEDV-HN4）PEDV-S基因序列進(jìn)行核苷酸和氨基酸的同源性分析（表2）。

2.5 PEDV-S系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

PEDV-S基因序列同源性比較的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹見圖3。

3 分析與討論

豬流行性腹瀉病毒刺突蛋白S基因保守性非常高，是主要的抗原表位所在域，PEDV-S基因結(jié)構(gòu)和功能與該病毒的致病性、感染性、中和抗體的產(chǎn)生和細(xì)胞結(jié)合能力密切相關(guān)[12-13]。本研究表明，PEDV流行毒株的刺突蛋白基因不論在基因和蛋白質(zhì)同源性上，還是在系統(tǒng)進(jìn)化樹上，與PEDV經(jīng)典毒株CV777、DR13等疫苗株均存在顯著差異，其基因的保守同源性只有92.7%～92.8%，從PEDV-S基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹上可以看出，PEDV流行毒株與經(jīng)典疫苗株分為不同的組群，表明PEDV流行毒株與經(jīng)典疫苗株抗原表位的刺突蛋白S出現(xiàn)了基因多樣性及保守性的變化[14]。

3.1 PEDV-S基因同源性分析

Meg Align軟件進(jìn)行同源性分析，PEDV進(jìn)化上主要有G1和G2這2個基因組型，G1型以經(jīng)典毒株為主，包括CV777、KPEDV-9和CH/S株等，G2型則以近年分離的毒株為主，包括HB3-CH2012、CXHZ-CH2013、HNCZ-CH2013等。PEDV-HN1、PEDV-HN2、PEDV-HN3和PEDV-HN4的同源性為97.6%～100.0%，與參考病毒株CV777、DR13、KPEDV-9等的同源性為92.6%～93.3%。

分離株P(guān)EDV-HN1、PEDV-HN2、PEDV-HN3和PEDV-HN4與參考病毒株CV777相比，比經(jīng)典毒株多2個插入突變和1個缺失突變，其中一個插入部位在流行毒株的第58～59位之間插入（QGVN），另一個插入部位在流行毒株139～140（N），流行毒株62～164（KNI）位存在缺失突變，與經(jīng)典毒株CV777蛋白質(zhì)同源性相比，分離株的多個氨基酸位點(diǎn)發(fā)生突變，共有65個位點(diǎn)發(fā)生氨基酸突變：第2～5位（TPLI→KSLT）、第15位（L→T）、第27～30位（QSTI→SANT）、第64位（S→T）、第68～74位（GTGIETD→AGQHPTA）、第86～87位（DS→RG）、第89位（Q→H）、第118位（S→N）、第138位（V→A）、第157～163位（LQDGKNI→HSEHS-—）、第200～202位（KRS→SGG）、第210位（T→E）、第227～229位（SYQ→YYE）、第236位（S→Y）、第246～247位（DS→EP）、第270位（L→V）、第286位（W→L）等。

3.2 PEDV-S基因蛋白抗原位點(diǎn)變化

ExPASy分析經(jīng)典毒株CV777的S蛋白抗原表位表明，它有51個潛在的抗原位點(diǎn)，而PEDV-HN1株預(yù)測存在56個抗原位點(diǎn)，PEDV-HN4株存在57個抗原位點(diǎn)，PEDV-HN2和PEDV-HN3株均含有54個抗原位點(diǎn)。與參考毒株CV777相比，分離株P(guān)EDV-HN1、PEDV-HN2、PEDV-HN3和PEDV-HN4在130～136位缺失1個抗原位點(diǎn)，而新增加的抗原位點(diǎn)（第159～165位氨基酸、第191～199位氨基酸和第631～610位氨基酸）主要出現(xiàn)在豬流行性腹瀉病毒的S1區(qū)。

3.3 PEDV-S基因蛋白糖基化位點(diǎn)變化

ExPASy分析PEDV S蛋白糖基化位點(diǎn)可知，CV777及PEDV-HN2株中存在29個N-糖基化修飾位點(diǎn)，而 PEDV-HN1、PEDV-HN3、PEDV-HN4株含有28個N-糖基化位點(diǎn)。4株分離毒株與CV777相比，其N-糖基化位點(diǎn)出現(xiàn)3處改變，第57位氨基酸由NSSS變?yōu)镹STW，第1196位氨基酸增加了1個N-糖基化位點(diǎn)NHTA，第230位氨基酸有1個N-糖基化位點(diǎn)缺失NCTG。

3.4 PEDV-S基因跨膜螺旋法

通過SOSUI預(yù)測PEDV S蛋白跨膜螺旋區(qū)分析可知，經(jīng)典毒株CV777在第1331～1356位氨基酸形成了首個跨膜螺旋域，在第2～24位氨基酸形成第二次跨膜螺旋域。而PEDV-HN1和 PEDV-HN4毒株在第1337～1359位氨基酸形成首次跨膜螺旋域，在第1～23位氨基酸形成第二次跨膜螺旋，PEDV-HN2和PEDV-HN3在第1328～1350位氨基酸形成了首次跨膜螺旋域，在第1～23位氨基酸和第 1356～1378位氨基酸分別形成了第二次跨膜螺旋域[16]。

3.5 PEDV-S基因的遺傳演化趨勢

Meg Align軟件進(jìn)行同源性分析，豬流行性腹瀉病毒進(jìn)化上可以分為G1和G2這2個不同的基因組型。同源分析的24株P(guān)EDV中，9株P(guān)EDV為G1基因組型，占37.5%，15株P(guān)EDV為G2基因組型，占62.5%。近年，PEDV主要的流行優(yōu)勢毒株也位于G2基因組型中，G1基因組型主要是經(jīng)典CV777、DR13、KPEDV等疫苗株以及我國發(fā)現(xiàn)的部分毒株。最近出現(xiàn)的流行株G2群，除在我國發(fā)現(xiàn)外，也出現(xiàn)在東北亞國家日本和韓國，此次分離鑒定的4株毒株均屬于G2群，我國近年分離的PEDV流行毒株與G2群同源性最高，結(jié)果說明我國跨地域的生豬調(diào)配導(dǎo)致不同區(qū)域的毒株之間存在交叉感染基因重配，可能與PEDV的傳播和致病有一定相關(guān)性。系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)化不同分支的時間顯示，不同時代鑒別的PEDV流行毒株有相同的進(jìn)化方向，并不存在明顯的時空聚集性[15]。

豬流行性腹瀉病是嚴(yán)重影響我國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重要傳染病之一，給生豬飼養(yǎng)、育種等造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在很長一段時間內(nèi)由于疫苗的使用減少了該病的感染，但同時由于疫苗長期使用導(dǎo)致PEDV的基因發(fā)生突變[17]。通過本研究發(fā)現(xiàn)，目前我國廣泛流行的豬流行性腹瀉病毒株與以往經(jīng)典毒株相比已經(jīng)存在一些在基因序列及蛋白結(jié)構(gòu)方面的明顯差異，這可能是疫苗免疫失敗的主要原因之一。

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