程福珍，洪燕，鄭榮泉,2*，梅祎蕓，王志剛，張丹丹，李賢露

(1.浙江師范大學野生動物保護與利用技術中心 野生動物生物技術與保護利用浙江省重點實驗室，浙江 金華 321004;2.浙江師范大學 行知學院，浙江 金華 321004)

抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)是機體在受到病原體感染時產生的一類小分子多肽[1-2]，具有抗菌、抗病毒等生物活性，因其不易產生菌株耐藥性，成為各行業(yè)“新寵”[3]。棘胸蛙(Quasipaaspinosa)是我國特有的兩棲動物，俗稱石雞、石蛙、棘蛙，屬于兩棲綱、無尾目、蛙科、棘蛙屬，主要分布于我國長江以南地區(qū)的山澗溪流中。棘胸蛙體型碩大，肉質細嫩，味道鮮美，具有清涼滋補、健肝胃、防癌抗癌等多種功效，兼具美食和藥用價值，素有“百蛙之王”的美名[3]。目前對棘胸蛙的研究主要集中在養(yǎng)殖和生物學特征等方面[4]，如人工養(yǎng)殖[5-6]、個體發(fā)育[7-8]、食性[9-10]、形態(tài)特征[11-12]、疾病防治[13-14]、染色體組型[15]等，而在生物活性肽領域的研究較少。已有研究表明，在棘胸蛙抗菌肽Spinosan-A、Spinosan-B、Spinosan-C、Spinosan-D中，Spinosan-D對革蘭氏陰、陽性菌的抗菌效果最佳[16]。

本研究對棘胸蛙抗菌肽Spinosan-D的原核表達進行研究，以期為其進一步開發(fā)利用提供理論和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒與菌株

質粒pET-32a(+)，北京Solarbio科技有限公司；E.ColiDH5α，日本TaKaRa公司；基因工程菌EColiBL21(DE3)pLysS，北京全式金生物有限公司。

氨芐霉素(母液濃度100 mg·mL-1，使用時每100 mL培養(yǎng)基添加50 μL氨芐霉素)、異丙基-β-D-硫代吡喃半半乳糖苷(IPTG)、LB培養(yǎng)基粉、甲酸、QuickCutHindⅢ限制性內切酶、QuickCutEcoR I限制性內切酶和DNA凝膠回收試劑盒，購于日本TaKaRa公司；Taq PCR Mastermix，購于康為世紀生物公司；Ni-NTA親和層析凝膠樹脂試劑盒、In-Fusion克隆試劑盒，購于美國Clontech公司；DNA Marker、11～245 ku蛋白質Marker和質粒抽提試劑盒，購于天根生化科技(北京)有限公司；LB培養(yǎng)基、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、蛋白質染色液和蛋白質脫色液，購于上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因合成

參考文獻[4]，設計含有EcoR I和Hind Ⅲ酶切位點、甲酸切割位點和蛋白質終止密碼子的編碼Spinosan-D成熟肽的核酸序列(5′-GAATTCGATCCGATGGAGGAGCTCTACAAAGAAATCGACGA TTGTGTGAATTATGGCAATTGTAAAACCTTGAAACT CATGTAAAAGCTT-3′)。其中，GAATTC為EcoR Ⅰ酶切位點，AAGCTT為Hind Ⅲ酶切位點，GATCCG為甲酸切割位點。利用TaKaRa Clotech在線生成基因序列軟件設計特異性引物F(5′-ATCGGATCCGAATTCGATCCGATGGAGGAGCTCTA CAAA-3′)和R(5′-TGCGGCCGCAAGCTTTTACAT GAGTTTCAAGGTTTTACAATTGCCATA-3′)，全基因合成于T-Vector pMD19普通載體上。PCR反應體系為：DNA模板1 μL，上、下游引物各1 μL，反應混合液12.5 μL，加ddH2O至25 μL。PCR反應程序為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共29個循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。反應結束后以1%瓊脂糖凝膠電泳分析是否獲得所需基因片段。

1.2.2 重組表達質粒的構建及鑒定

用限制性內切酶EcoR I和Hind Ⅲ雙酶切質粒pET-32a(+)，回收線性化載體片段，取目的基因片段，用In-Fusion連接酶連接，構建pET-32a(+)重組表達載體pET-32a(+)-Spinosan-D，并轉化至E.ColiDH5α感受態(tài)細胞，挑取陽性單克隆進行菌落PCR鑒定。PCR反應體系為：菌液1 μL，pET-32a(+)通用引物S.TAG、T7 TER各1 μL，反應混合液12.5 μL，加ddH2O至25 μL。PCR反應程序為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共29個循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。PCR產物送至上海生工生化公司測序，運用Seqman和MEGA序列分析軟件分析測序結果。

1.2.3 重組質粒的誘導表達

轉化重組質粒至E.ColiBL21(DE3)pLysS感受態(tài)細胞中，再轉入另一培養(yǎng)基，37 ℃、200 r·min-1搖床培養(yǎng)至菌液的D600值為0.7。取1 mL菌液作為誘導前樣品，1 mL菌液中加入終濃度為1 mmol·L-1IPTG進行誘導表達(37 ℃、160 r·min-1條件下振搖4 h)，取1 mL菌液作為誘導后樣品。取誘導前、后樣品，12 000 r·min-1離心2 min，各加入40 μL PBS溶液懸浮菌體沉淀，加入10 μL的5×蛋白上樣緩沖液，以100 ℃煮沸10 min，取上清，分別取處理過的樣品各20 μL，進行12% SDS-PAGE電泳檢測。

Whether in cooling or in energy generation mode, the efficiency of a thermoelectric device increases with the increasing of the figure-of-merit of the used thermoelectric semiconductors. The latter is written as[1]:

1.2.4 誘導條件優(yōu)化

不同誘導表達條件下，蛋白的表達量不同。為使蛋白得到高效表達，進行誘導溫度(16 ℃、28 ℃、37 ℃)、誘導時間(4、8、12 h)及IPTG終濃度(0.1、0.5、1.0 mmol·L-1)3因素3水平正交試驗，探索最佳誘導表達條件，12% SDS-PAGE電泳檢測表達結果。

1.2.5 重組蛋白的純化

以最佳誘導條件對重組菌進行大量誘導表達，離心收集菌體，冰上超聲裂解，離心，收集上清并過濾，對重組蛋白進行純化，收集蛋白洗脫液，12% SDS-PAGE電泳分析目的蛋白。洗脫的目的蛋白加入終濃度為40%的甲酸，37 ℃培養(yǎng)36 h，37 ℃氮吹出去甲酸，加入1×PBS溶液清洗3次，最后用1×PBS溶液溶解。

1.2.6 重組蛋白生物活性檢測

將一定濃度的E.ColiDH5α菌液均勻涂布于固體培養(yǎng)基表面，將滅菌濾紙片按合適間距置于培養(yǎng)基表面，分別加入10 μL 1×PBS溶液、抗菌肽、1 mg·mL-1氨芐霉素，封口膜密封培養(yǎng)皿，水平倒置，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，觀察抑菌圈是否形成及其大小。其中，氨芐霉素處理作為陽性對照，1×PBS溶液處理作為陰性對照。

2 結果與分析

2.1 Spinosan-D基因擴增及重組表達載體構建及鑒定

Spinosan-D基因PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析大小為108 bp(圖1)，目的基因片段擴增成功。

M，DNA分子質量標準；a，Spinosan-D基因擴增產物

使用限制性內切酶EcoRⅠ和Hind Ⅲ對質粒pET-32a(+)進行雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳對雙酶切后的線性化載體進行分析(圖2)，條帶符合預期結果，成功獲得線性化載體。純化回收的線性化載體，經酶標儀測量，濃度為14.5 ng·μL-1，目的基因片段濃度為62.5 ng·μL-1。

M，DNA分子質量標準；a，經雙酶切的線性化pET-32a(+)載體；b，未經雙酶切的環(huán)狀pET-32a(+)載體

菌液PCR后經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶大小為267 bp(圖3)，符合預期結果，初步鑒定重組質粒構建成功。基因測序結果表明，已成功構建重組質粒。

2.2 重組質粒的誘導表達

對含重組質粒的E.ColiBL21(DE3)pLysS大腸桿菌誘導表達后，結果表明，含IPTG誘導劑的目的條帶大小處有蛋白表達，而無IPTG誘導劑的在目的條帶大小處無蛋白表達(圖4)，表明融合蛋白在誘導劑IPTG作用下已經成功表達。

M，DNA分子質量標準；a，菌液PCR擴增產物

M，蛋白質分子質量標準；a，誘導前；b，誘導后

2.3 誘導條件優(yōu)化

研究發(fā)現，37 ℃條件下，融合蛋白的表達量更多(圖5)，故將最佳誘導溫度定為37 ℃。37 ℃條件下，不同誘導時間表達的融合蛋白量差異不明顯，選擇最短處理時間4 h為誘導時間。在37 ℃、誘導4 h時，1.0 mmol·L-1IPTG誘導表達的融合蛋白最多，故最佳誘導條件為：37 ℃，1.0 mmol·L-1IPTG處理4 h。

A、B、C分別為16 ℃、28 ℃、37 ℃時不同IPTG終濃度及誘導時間下重組質粒的誘導表達。M，蛋白質分子質量標準；a1、a2、a3、b1、b2、b3、c1、c2、c3分別表示誘導時間和IPTG終濃度為4 h、0.1 mmol·L-1，4 h、0.5 mmol·L-1，4 h、1.0 mmol·L-1，8 h、0.1 mmol·L-1，8 h、0.5 mmol·L-1，8 h、1.0 mmol·L-1，12 h、0.1 mmol·L-1，12 h、0.5 mmol·L-1，12 h、1.0 mmol·L-1誘導條件下的重組質粒誘導表達

2.4 重組蛋白的純化

純化蛋白樣和未純化蛋白樣在20～25 ku有一條明顯條帶，約為21.2 ku(圖6)，符合預期結果，因此純化蛋白樣成功。

M，蛋白質分子質量標準；a，純化后；b，純化前

2.5 重組蛋白生物活性鑒定

在E.ColiDH5α菌株生長的平板上，陰性對照的PBS溶液周圍菌株生長正常；陽性對照的氨芐霉素周圍有抑菌圈；重組蛋白Spinosan-D周圍也存在抑菌圈(圖7)，表明抗菌肽Spinosan-D具有一定的抗菌活性。

3 討論

Dong等[16]從棘胸蛙皮膚中克隆出4條cDNA序列，并進行了人工合成，根據抗菌肽的氨基酸組成特點以及二級結構特點，將其命名為Spinosan-A、Spinosan-B、Spinosan-C、Spinosan-D。ProtParam分析表明，4種棘胸蛙抗菌肽的分子量在1 284～2 753，理論等電點在3.92～8.06，除Spinosan-C是陽離子多肽，其余的都是陰離子多肽。HNN在線二級結構預測軟件分析表明，Spinosan-A、Spinosan-B以及Spinosan-C均沒有α-螺旋，具有較多的β-折疊和無規(guī)則卷曲，Spinosan-D具有明顯的兩親性且有43.48%的α-螺旋趨勢，而抗菌肽中的α-螺旋結構能夠使微生物的細胞膜表面出現小孔，在不損傷正常細胞的前提下對細菌、真菌、病毒和癌細胞等有殺傷作用[17-18]，對抗菌肽的抗菌活性具有重要的作用。抗菌肽的溶血活性試驗顯示，80 μg·mL-1的高濃度棘胸蛙抗菌肽樣品對家兔紅細胞具有極微弱的溶血活性[19]。因此，對比4種棘胸蛙皮膚抗菌肽，Spinosan-D的各種活性效果更佳且穩(wěn)定。本研究對棘胸蛙抗菌肽Spinosan-D成熟肽進行原核表達，為大量制備和利用這一具有重要應用前景的活性肽提供基礎。

自抗菌肽首次被發(fā)現，人們已從細菌、真菌、兩棲類、高等動植物乃至人類中發(fā)現并分離獲得抗菌肽。抗菌肽具有分子量小、良好的熱穩(wěn)定性和水溶性、廣譜抗菌活性及作用細菌后不易產生耐藥性、對病毒和癌細胞具有殺傷作用等特點受到關注，被廣泛應用于醫(yī)藥、食品、化妝品及轉基因動植物農業(yè)等領域，顯示出巨大的應用前景。由于天然抗菌肽在兩棲類動物機體中含量低且直接提取步驟復雜，化學合成20個以上的氨基酸成本高、難度較大且具有一定的污染性，因此，基因工程表達法是抗菌肽大規(guī)模生產的最佳途徑。利用基因工程方法表達蛋白質已在酵母、昆蟲、大腸桿菌等多種異源宿主中獲得成功[20]。巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)和大腸埃希菌表達系統(tǒng)是表達蛋白質的常用系統(tǒng)。巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)生產的菌株穩(wěn)定，可以處理含二硫鍵的表達蛋白并能對表達后的蛋白進行修飾，使得結構復雜的蛋白表達后仍能保持其生物活性[21-22]?，F已報道的有14%的抗菌肽運用了巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)表達成功[23]，如Enterocin P[24]和ABP-CM4[25]等。然而，巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)同時也有不足之處，例如蛋白質表達后難以純化，相對比大腸埃希菌原核表達系統(tǒng)成本高，周期也相對較長等。大腸埃希菌表達系統(tǒng)是目前應用最多、最完善、研究最為成熟的表達系統(tǒng)，該表達系統(tǒng)具有生產工藝簡單、周期短、能夠低成本進行大規(guī)模發(fā)酵等特性，適合結構簡單蛋白質的表達?？咕慕Y構簡單，不同于結構復雜的蛋白質需要經過翻譯后的修飾加工過程才能轉化成活性形式，故本研究選用大腸桿菌原核表達系統(tǒng)進行表達[26]。因抗菌肽分子量小，難以折疊正確和穩(wěn)定表達，易被宿主細胞中的酶水解，并且自身的抗菌作用會對宿主細胞產生毒性，目前對抗菌肽的原核表達幾乎都采用融合表達[27-28]，該表達方式便于純化，提高融合蛋白的可溶性表達，可避免蛋白酶作用以提高蛋白穩(wěn)定性[29]，又可使宿主細胞免于表達蛋白的毒性，目前通過融合表達的方法已成功獲得多種抗菌肽。

In-Fusion HD是一種相比于傳統(tǒng)克隆技術更加簡便、快速、高效的克隆技術，反應時間僅需15 min，同時具備不受限制性內切酶酶切位點限制的特點，克服了傳統(tǒng)克隆技術連接效率低、耗時長且需要特定限制性酶切位點的缺陷。Novagen的pET系統(tǒng)因基因被克隆到不被大腸埃希菌RNA聚合酶識別的T7啟動子之下而成為在大腸埃希菌中蛋白表達的首選，所以只有加入T7RNA聚合酶后，才會有表達。克隆到pET載體的基因是被關閉的，不會因為產生的蛋白對細胞有毒性而引起質粒不穩(wěn)定。重組質粒轉移到染色體上，含有一拷貝由lacUV5控制的T7RNA聚合酶基因的表達宿主中，并通過加入IPTG誘導表達；也可通過ICE6感染原始克隆宿主菌來提供T7RNA聚合酶。對于使用大腸埃希菌啟動子系統(tǒng)有困難的部分基因已在pET系統(tǒng)中實現穩(wěn)定克隆和表達。T7RNA聚合酶的選擇性和活性使得幾乎所有細胞資源都用于目標基因表達，誘導后幾小時目標產物就可超過細胞總蛋白的50%。pET-32a(+)中帶有硫氧還蛋白標簽，使可溶性融合蛋白得到更大量的表達[30]，并能促進蛋白質的正確折疊[31-32]。本研究選用了pET系統(tǒng)中的pET-32a(+)作為構建重組質粒的載體，PCR得到目的基因，運用克隆高效、簡便、快速的In-Fusion HD技術成功獲得了重組質粒Spinosan-D-pET-32a(+)。

規(guī)?；苽浼夹g的研究，是開發(fā)和利用抗菌肽的基礎和保障。本研究利用原核表達技術成功獲得具有抗菌活性的抗菌肽Spinosan-D，是對規(guī)?；苽浼夹g的有益探索。在今后的工作中，尚有以下幾方面值得進一步深入研究：一是優(yōu)化含Spinosan-D-pET-32a(+)的E.ColiBL21(DE3)pLysS大腸埃希菌重組菌株的誘導表達條件或優(yōu)化Spinosan-D成熟肽基因；二是在本研究基礎上，開展棘胸蛙抗菌肽Spinosan-D原核表達的優(yōu)化試驗，以進一步提高抗菌肽Spinosan-D的表達量；三是可開展抗菌肽Spinosan-D在真核生物表達系統(tǒng)中的分泌表達研究，比較不同表達系統(tǒng)的表達量，生物活性及試驗成本等。