馬小迪，譚嫣，王久照，劉小剛，曾明*

(1.西南大學 園藝園林學院，重慶 400715； 2.南方山地園藝學教育部重點實驗室，重慶 400715)

金柑(FortunellacrassifoliaSwingle.)，蕓香科金柑屬植物。金柑植株發(fā)育童期短，當年抽生枝條即可開花結(jié)果，具有一年多次開花結(jié)果的特性；金柑果實顏色金黃，在春節(jié)前后成熟，寓意吉祥喜慶；味道甘甜可口，作為少見的帶皮食用型柑橘類中國特色水果，風味獨特，其營養(yǎng)與醫(yī)藥保健功能受到廣泛關(guān)注。

類黃酮(flavonoids)是重要的一類多功能性次生代謝產(chǎn)物，在植物中具有抗病原菌、抗UV、抗鹽、抗旱等作用，也是一種對人體有益的營養(yǎng)物質(zhì)。已有報道對葡萄[1]、梨[2]、草莓[3]等類黃酮的合成進行了研究。金柑雖為柑橘近緣屬植物，但在類黃酮組成含量上具有差異性。柑橘以黃烷酮和黃酮為主[4-5]，主要存在于血橙中的花青苷和檸檬中的黃酮醇[6]等，而金柑含有豐富的二氫查爾酮和根皮素-3′,5′-二碳葡萄糖苷[7-8]，是研究類黃酮合成的一種特色材料。

目前，對金柑的研究主要集中在栽培管理與保鮮技術(shù)、活性物質(zhì)的含量檢測與提取利用等方面，對抗逆基因和開花基因僅進行了初步研究。徐志龍等[9]研究了不同砧木對陽朔金柑樹體和果實品質(zhì)的影響；周翡云等[10]對融安金柑結(jié)果母枝質(zhì)量與果實品質(zhì)進行了相關(guān)性分析；Kondo等[11]研究了環(huán)境因子對金柑抗氧化活性的影響；Barreca等[12]對金柑類黃酮的抗氧化性能進行了測定；龔小慶[13]以金柑為材料，克隆了3個抗逆基因，并且鑒定解析了基因的功能及其作用機制；胡穎[14]對融安金柑花器官發(fā)育轉(zhuǎn)錄特征進行了分析，并研究了相關(guān)基因的功能；張奕[15]克隆了融安金柑開花關(guān)鍵基因，并對其功能進行了初步分析。

類黃酮通過苯丙烷途徑(phenylpropanoid pathways)進行生物合成，是次生代謝研究的主要方向。查爾酮合成酶(chalcone synthase，CHS)和查爾酮異構(gòu)酶(chalcone isomerase，CHI)是類黃酮合成過程中的關(guān)鍵酶。查爾酮合成酶催化3分子丙二酰-CoA和1分子對香豆酰-CoA縮合形成查爾酮，是類黃酮合成的重要限速步驟[16-17]。查爾酮異構(gòu)酶催化柚皮苷查爾酮異構(gòu)化，形成生物活性二羥基黃烷酮，該酶是第1個被認識的黃酮類化合物合成相關(guān)酶。CHS和CHI基因已從很多植物中被克隆且進行了功能鑒定，如金魚草、碧冬茄、玉米、圓葉牽牛、非洲菊、擬南芥和小立碗蘚[18-26]。

近年來，生物活性物質(zhì)相關(guān)基因的表達研究已成為果實品質(zhì)研究的一個熱點，但對金柑類黃酮合成相關(guān)基因的克隆與表達研究還未見報道。本研究從金柑中分離CHS和CHI編碼基因，通過qRT-PCR(quantitative real time polymerase chain reaction)定量分析它們在果實成熟過程中的表達模式，進一步分析基因表達與類黃酮積累的相關(guān)性，探索類黃酮生物合成途徑中關(guān)鍵基因的遺傳調(diào)控機制，以期為金柑類黃酮的合成機理研究提供基礎(chǔ)信息，對調(diào)控柑橘次生代謝產(chǎn)物合成、提高類黃酮產(chǎn)量提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料

實驗材料為不同發(fā)育階段的瀏陽金柑果實，采集于中國農(nóng)業(yè)科學院柑橘研究所國家果樹種質(zhì)重慶柑橘圃，樹齡約10年。于花后15、31、69、99、130及156 d采集果實樣品，其中花后15和31 d的果實，由于果皮和果肉不能有效分離，所以將果實作為整體進行分析，而其他時期果實的果皮和果肉分別進行分析。樣品采集后，置于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 類黃酮測定

稱取烘干樣品0.5 g于10 mL離心管，加入10 mL 70%乙醇，混勻，超聲破碎30 min(功率60%，水溫45 ℃)，濾液濃縮除去有機溶劑，用4 mL蒸餾水定容備用。取適當稀釋的1 mL待測液轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，加入0.3 mL 5% NaNO2，搖勻；靜置10 min后加入0.3 mL 10% AlCl3，搖勻；放置10 min后再加入2 mL 4% NaOH，搖勻；最后用60%乙醇定容至10 mL，15 min后于510 nm測定吸光值。以蘆丁作為標樣制備標準曲線。

1.3 qRT-PCR定量分析

采用大連寶生物公司的MiniBEST Plant RNA Extraction Kit試劑盒提取果實總RNA，用天根公司FastQuant RT Super Mix試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，隨后基于SYBR法對基因進行qRT-PCR驗證。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)，內(nèi)參基因為Actin。

表1 用于qRT-PCR分析的引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 基因克隆及其序列特征

使用以下流程，獲取金柑CHS和CHI編碼序列。第一步，以擬南芥CHS和CHI蛋白為Query序列，用BlastP工具檢索甜橙和克萊門氏小柑橘的蛋白數(shù)據(jù)庫。在克萊門氏小柑橘蛋白數(shù)據(jù)庫中，發(fā)現(xiàn)了4個候選CHS和2個候選CHI，而在甜橙中界定了同樣數(shù)量的CHS和CHI，隨后從NCBI中獲取相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄本序列。第二步，使用HISAT軟件，以上述候選CHS和CHI轉(zhuǎn)錄本序列為模板，從實驗室之前測序完成的金柑果實轉(zhuǎn)錄組中獲取編碼CHS和CHI的reads。第三步，使用Trinity軟件將這些reads組裝成完整的轉(zhuǎn)錄本序列；第四步，對于不完整的轉(zhuǎn)錄本，采用FPNI-PCR進行序列補齊。最終，在金柑中界定了3個候選CHS(FmCHS1～FmCHS3)和2個金柑CHI(FmCHI1和FmCHI2)。FmCHS1、FmCHS2和FmCHS3分別編碼390個、391個和391個氨基酸殘基多肽，預(yù)測分子量為42.61、42.66和42.73 ku，等電點為5.71、6.28和5.70。FmCHI1和FmCHI2，分別編碼222和209個氨基酸殘基多肽，預(yù)測分子量為23.99和23.20 ku，等電點為5.15和5.00。

2.2 基于進化樹的功能預(yù)測

采用近鄰相接法(Mega 6.0)，分別構(gòu)建FmCHS和FmCHI氨基酸序列進化樹(圖1和圖2)?；谶M化聚類關(guān)系(圖1)，F(xiàn)mCHS1和FmCHS2能與已知功能CHS緊密聚為一類，界定為CHS蛋白；而FmCHS3單獨聚類，界定為CHS-like蛋白。

已有研究表明，CHI蛋白能夠被分為4種類型。類型Ⅰ(Type Ⅰ)廣泛存在于維管植物，而類型Ⅱ(Type Ⅱ)為豆科植物所特有[27]。這兩類CHI蛋白都屬于bona fide CHI，具有CHI酶催化活性，參與植物類黃酮合成。類型Ⅲ(Type Ⅲ)在擬南芥中被顯示為脂肪酸束縛蛋白(fatty acid-binding proteins，F(xiàn)APs)，而類型Ⅳ(Type Ⅳ)在擬南芥中與類型Ⅰ的CHI蛋白互作促進類黃酮合成?；谶M化聚類關(guān)系(圖2)，F(xiàn)mCHI1界定為類型Ⅰ CHI蛋白，而FmCHI2界定為類型Ⅳ CHI蛋白。

圖1 基于CHS基因的編碼蛋白構(gòu)建進化樹

圖2 基于CHI基因的編碼蛋白構(gòu)建進化樹

2.3 基因表達與類黃酮含量的關(guān)系

為進一步明確CHS和CHI基因在果實生長發(fā)育過程中對類黃酮生物合成所起的作用，分別檢測金柑果實生長發(fā)育過程中果皮和果肉的類黃酮含量，并通過qRT-PCR檢測基因在同一時期的表達水平。從圖3可以看出，在花后15、69 d果實中類黃酮含量最高；從花后69 d開始，隨著果實生長發(fā)育，金柑果皮中類黃酮含量呈現(xiàn)明顯下降，而果肉中類黃酮含量呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢；但總體而言，果皮中的類黃酮含量始終高于果肉中類黃酮含量。

P，果皮；R，果肉。圖3～4同

qRT-PCR結(jié)果顯示(圖4)，在金柑果實發(fā)育過程中，F(xiàn)mCHS1基因呈先高后低的表達趨勢，在15和31 d果實中表達量遠遠高于其他時期；而FmCHS2則呈降、升、降的變化趨勢，其中在69 d果肉和99 d果皮中表達量高于其他組織或時期；FmCHS3表達量在整個果實發(fā)育過程中沒有明顯變化，始終處于低水平、波動的表達模式。在果實發(fā)育過程中，F(xiàn)mCHI1的表達在早期緩慢下降，之后呈低水平、波動的表達模式；而FmCHI2呈先上升后下降的變化模式。

圖4 金柑果實中3個FmCHS(A)2個FmCHI (B) 基因的相對表達量

3 討論

查爾酮合成酶和查爾酮異構(gòu)酶的有關(guān)研究已成為一個熱點，但大多以模式植物和少數(shù)作物為研究對象。在擬南芥中，具催化活性的CHS(tt4，At5G13930)和CHI(tt5，At3G55120)都是單基因編碼，且功能已驗證。在此基礎(chǔ)上，目前的研究逐漸深入到CHS和CHI基因上游調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的挖掘及翻譯后修飾。例如，最近在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了一個能夠與CHS蛋白互作的KFBCHS蛋白，介導(dǎo)CHS的泛素化及降解[28]。KFBCHS的表達顯示了組織特異性及時空特異性，并對各種光信號具有很強的響應(yīng)。擬南芥At5G05270基因編碼類型Ⅳ CHI，這類CHI蛋白本身并無催化活性，但它能與類型Ⅰ CHI蛋白互作，提升擬南芥中花青素及類黃酮含量[29-30]。

然而，一些雙子葉植物CHS和CHI由多基因編碼，使得進一步深入研究變得困難。通過構(gòu)建進化樹進行聚類分析，本實驗從金柑中界定了3個CHS，F(xiàn)mCHS1和FmCHS2能與已知功能CHS緊密聚為一類，界定為CHS蛋白；而FmCHS3單獨聚類，界定為CHS-like蛋白。最近一項研究，在蘋果基因組中界定了3個CHS(MdCHS1、MdCHS2及MdCHS3)，體外酶活性測定發(fā)現(xiàn)這3個基因均具有催化活性[31]。此外，本實驗發(fā)現(xiàn)FmCHI1能與擬南芥CHI/TT5聚類，這個基因可能具有催化活性，F(xiàn)mCHI2界定為類型Ⅳ CHI蛋白?；谇叭说难芯拷Y(jié)果，我們推測FmCHI2能與FmCHI1互作，進而促進類黃酮的合成，但仍有待通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)等對其進行功能驗證。

CHS和CHI是類黃酮合成途徑中兩個關(guān)鍵酶，定位于整個途徑上游。從理論上講，下游類黃酮合成都受這兩個酶的影響。大量研究表明，CHS和CHI基因的表達與類黃酮含量呈現(xiàn)密切關(guān)系。最經(jīng)典的例子為擬南芥tt4和tt5突變體互補實驗，Dong等[32]將玉米的CHS(C2)和CHI(CHI1)基因分別導(dǎo)入擬南芥tt4和tt5突變體，發(fā)現(xiàn)植物能夠積累類黃酮和花青素。相似的情況也發(fā)生在將小蒼蘭CHS(FhCHS1)導(dǎo)入擬南芥tt4突變體[33]。在將FhCHS1導(dǎo)入矮牽牛時，發(fā)現(xiàn)矮牽?；ㄉ砂咨?yōu)榉奂t色[23]。在銀杏中，CHS表達水平與類黃酮含量之間呈顯著正相關(guān)[34]。在本研究中，F(xiàn)mCHS1、FmCHS2、FmCHI1和FmCHI2在果實發(fā)育過程中均存在一個階段性高表達，并與類黃酮積累顯示一定的相關(guān)性，說明這幾個基因在金柑類黃酮生物合成中具有重要作用。在金柑果實發(fā)育過程中，F(xiàn)mCHS1和FmCHI1表達量較高，與類黃酮積累模式最為接近，因此，它們可能直接參與了金柑果實類黃酮的合成。