呂國英，張作法*，陳建飛，毛榮良，劉世柱

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學院 園藝研究所，浙江 杭州 310021； 2.衢州菇樂農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，浙江 衢州 324000；3.常山縣森力家庭農(nóng)場，浙江 常山 324200； 4.浙江方格藥業(yè)有限公司，浙江 慶元 323800)

猴頭菇(Hericiumerinaceus)又名猴頭菌、刺猬菌，是一種大型的食藥用真菌，因其形狀酷似金絲猴頭，而得名。猴頭菌的食用歷史悠久，營養(yǎng)豐富，主要活性成分有多糖、低聚糖、萜類和酚類等，具有抗癌、護胃、提高免疫力等多種藥理功效[1-2]。有關猴頭菇的功能性成分研究中，多糖護胃活性最受關注[3]，猴頭菇的抗氧化活性研究較少。

自由基是在生物體內呈游離狀態(tài)帶有不成對電子的分子、原子或離子。大量研究表明，氧自由基誘導的LPO反應與許多疾病的發(fā)生有密切的關系[4]。因此，尋找利于人體吸收的能清除體內過量自由基的外源活性自由基清除劑，成為人們關注的重點。本研究以抗氧化活性為指標，選取不同品種不同成熟度猴頭菇子實體，制備出具有優(yōu)良抗氧化活性的提取物，同時為猴頭菇功能食品的開發(fā)提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

猴頭菇1號、2號、99號不同生長時期的子實體由常山縣森力家庭農(nóng)場提供。DPPH、ABTS、過硫酸鉀購自Sigma，其他試劑為分析純。

1.2 樣品制備

選取猴頭菇1號、2號、99號3個品種不同生長時期的子實體(A未成熟，B成熟，C過熟)，60 ℃烘干粉碎過60目篩，備用。

取3.0 g猴頭細粉，加入100 mL 70%乙醇，90 ℃回流1 h，離心收集上清液，殘渣再次加入100 mL 70%乙醇，再次回流1 h。合并提取液，10 000 r·min-1離心5 min，取上清液旋蒸，得到醇提物，4 ℃下保存。測定時，取醇提物用70%乙醇配制成1～5 mg·mL-1的樣品待測液。

1.3 DPPH自由基清除率的測定

1 mL樣品待測液加入1 mL 0.01%的DPPH乙醇溶液，振蕩反應30 min后，在517 nm處測定吸光度。以70%乙醇溶液代替同樣體積的樣品作為空白，計算DPPH清除率[5]。

1.4 ABTS+清除率的測定

配制7 mol·L-1ABTS儲備液(2.46 mol·L-1過硫酸鉀溶液溶解ABTS)，室溫避光條件下靜置12～16 h；將ABTS以磷酸緩沖液(10 mmol·L-1，pH值7.4)稀釋，使其吸光度在734 nm處達到0.70±0.02。然后取2.5 mL的ABTS+測定液，加入1.0 mL的樣品待測液，準確振蕩30 s，在734 nm處測定吸光度，計算ABTS+清除率[6]。

1.5 羥自由基清除率的測定

1 mL樣品加入1 mL FeSO4(12 mmol·L-1)，再加入1 mL H2O2(12 mmol·L-1)，37 ℃下保溫10 min，再加入1 mL 6 mmol·L-1水楊酸，37 ℃下保溫30 min，然后10 000 r·min-1，4 ℃下離心10 min，取上清液在510 nm處測定吸光度。以70%乙醇溶液代替同樣體積的樣品作為空白，計算羥自由基清除率[7]。

1.6 還原力測定

取0.4 mL樣品，加入1 mL 0.2 mol·L-1磷酸鹽緩沖液，再加入1 mL 1%鐵氰化鉀溶液，混合液于50 ℃下水浴20 min，加入1 mL 10%三氯乙酸后，4 ℃下1 000g離心10 min，取2 mL上清液，加入0.2 mL 0.1%三氯化鐵溶液中，于700 nm處測定吸光度，吸光度值大則表示還原力強[8]。

2 結果與分析

2.1 清除DPPH自由基的能力

當DPPH自由基與抗氧化劑反應后，會隨著還原而逐漸褪色，在517 nm處的吸光度降低。由表1可以看出，3種猴頭菇的醇提物隨著濃度的增大，DPPH自由基清除能力增強，不同成熟度的子實體提取物的DPPH自由基清除率在未成熟時都表現(xiàn)出最高，5 mg·mL-1時，99號的清除率最高為59.5%，明顯優(yōu)于2號的清除率(48.7%)。黃越等[9]提取猴頭的粗多糖對清除DPPH自由基的研究表明，當粗多糖濃度為5 mg·mL-1時，3種多糖A-HeP、U-HeP和W-HeP對DPPH自由基的清除率分別為71.67%、55.12%和47.91%。實驗表明，猴頭菇中一些小分子物質與多糖等大分子同樣具有抗氧化效果。

表1 樣品DPPH自由基清除率

2.2 清除ABTS+的能力

含抗氧化成分的樣品與ABTS+發(fā)生反應而使反應體系褪色。ABTS+的最大吸收波長 734 nm處檢測吸光度的變化，可測定樣品對ABTS+自由基的清除能力。猴頭菇提取物對ABTS自由基的清除作用見表2。1號品種表現(xiàn)出優(yōu)秀的清除能力，不同成熟度的子實體提取物在2 mg·mL-1時的清除率均超過了95%，99號提取物在3 mg·mL-1的清除率也超過了95%，2號的ABTS+自由基的清除能力略遜于前兩者。吳美媛等[10]比較猴頭菇的不同溶劑提取物的ABTS+自由基的清除能力，猴頭菇熱水、乙醇及丙酮提取物2 mg·mL-1對ABTS+自由基的清除率分別為52.06%、63.84%，49.59%。說明不同品種與提取試劑對抗氧化作用有明顯的差異。

表2 樣品ABTS+清除率

2.3 清除羥自由基的能力

H2O2和Fe2+混合產(chǎn)生羥自由基，在體系內加入水楊酸，可捕捉羥自由基并產(chǎn)生有色物質，該物質在510 nm處有最大吸收。加入抗氧化物質，會與水楊酸形成競爭，使有色產(chǎn)物的生成量減少，通過吸光度的變化評價羥自由基的清除能力。猴頭菇提取物對羥自由基的清除能力見表3。3種猴頭菇的醇提物隨著濃度的增大清除能力增強，不同品種之間的清除率有較大的差別，99號品種在高濃度時羥自由基清除率在60.9%～70.8%，2號品種的清除率相對最弱，為23.7%～35.8%，但不同成熟度之間的清除能力沒有明顯的規(guī)律。

表3 樣品羥自由基清除率

2.4 還原力

還原能力是反映物質抗氧化活性的一個重要指標，還原力與抗氧化活性呈正相關，還原能力越大，抗氧化活性越高。表4表明，猴頭菇醇提物濃度為1～5 mg·mL-1時，還原力隨著濃度的升高快速增強，呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性，2號不同成熟度的還原能力都優(yōu)于1號和99號。何晉浙等[11]在研究不同產(chǎn)地的猴頭菇多糖的還原力時，當多糖濃度為5 mg·mL-1，其在700 nm處的吸光度都在0.55以下。Kozarski等[12]對靈芝多糖還原能力進行研究，當濃度為5 mg·mL-1時，其在700 nm處的吸光度的僅為0.23。說明猴頭菇醇提物具有良好的還原能力。

表4 樣品還原能力

3 小結

本研究以體外藥理活性為導向，比較了不同品種猴頭菇在不同成熟度時子實體70%乙醇提取物的體外抗氧化能力，以DPPH自由基、ABTS+自由基、羥自由基的清除率和還原力為指標。研究結果表明，不同品種的猴頭菇提取物均具有良好的抗氧化能力，但有較大的差別。1號和99號品種對DPPH自由基和ABTS+自由基的清除率優(yōu)于2號；2號品種的還原能力最強；99號品種的羥基清除能力最高。研究結果為猴頭菇保健品開發(fā)提供了思路和參考。