趙芳娥，李寶臣，孟超，鄭道光，張才喬

(1.浙江大學 動物科學學院，浙江 杭州 310058； 2.浙江詩華諾倍威生物有限公司，浙江 杭州 310018)

鴨傳染性漿膜炎(Riemerellaanatipestifer，RA)又稱鴨疫里默氏桿菌病，是一種侵害鴨、鵝、火雞等多種禽類的細菌性疾病[1-2]，主要感染2～7周齡雛鴨，常與其他細菌混合感染，嚴重影響?zhàn)B鴨業(yè)的發(fā)展，造成巨大的經(jīng)濟損失[3]。目前，疫苗免疫是預防和控制鴨傳染性漿膜炎的有效措施，但鴨疫里默氏桿菌血清型復雜，不同血清型之間交叉保護較低或缺乏，導致疫苗免疫失效。

機體的天然免疫系統(tǒng)是防御病原體入侵的第一道防線，動物機體表達不同的模式識別受體(pattern recognition receptor，PRRs)，識別病原體相關分子，從而引發(fā)、活化抗病毒基因的表達，實現(xiàn)宿主抵抗病原體的防御功能[4]。禽類PRRs已經(jīng)被鑒定，其中Toll樣受體是禽類先天免疫系統(tǒng)中的關鍵組分，在禽類傳染病的預防、控制方面極其重要[5]。Toll樣受體作為病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)的感受器，是介導宿主對各種病原體識別、產(chǎn)生免疫和炎癥反應的關鍵分子，激活時不僅會誘導天然免疫應答，同時還能激活獲得性免疫系統(tǒng)。在機體抵抗病原體研究方面，Toll樣受體2(toll-like receptors 2，TLR2)、Toll樣受體4(toll-like receptors 4，TLR4)是最為重要的2類受體。TLR2可特異性識別細菌表面的脂蛋白。TLR4能夠特異性識別革蘭氏陰性菌的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)[6-7]，特異性識別LPS后，其胞外部分與LPS結合形成復合物，形成的Toll樣受體—LPS復合物引起胞內(nèi)Toll樣受體C端TIR區(qū)招募胞漿內(nèi)的接頭蛋白，然后通過一系列酶生化反應，促進核轉錄因子κB(transcription factor κB，NF-κB)的核轉位，NF-κB進入到細胞核內(nèi)可對多種炎癥因子基因及免疫相關基因進行表達調(diào)控[8-9]，激活天然免疫[10]。參與獲得性免疫應答的輔助性T細胞1/2可被細胞因子和共刺激分子激活后增殖、分化，進一步會啟動機體的獲得性免疫系統(tǒng)[11-12]。

本研究將25日齡雛鴨人工染病，在感染24 h后采集免疫器官組織樣品，運用免疫組化和免疫印跡方法測定組織中Toll樣受體的分布與表達，qRT-PCR檢測部分細胞因子mRNA豐度的變化，旨在探索雛鴨天然免疫系統(tǒng)抵抗鴨疫里默氏桿菌感染的機理，為研究新型高效疫苗提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

鴨疫里默氏桿菌血清1型SG4株由中國農(nóng)業(yè)大學提供，25日齡雛鴨(紹興麻鴨)由紹興某種鴨場提供。

4%多聚甲醛、兔抗-Toll樣受體2多克隆抗體(BS7380)、兔抗-Toll樣受體4多克隆抗體(BS3489)、HRP標記的羊抗兔IgG等購自巴傲德生物科技有限公司；SABC試劑盒、DAB顯色液、BCA蛋白檢測試劑盒、ECL化學發(fā)光檢測試劑盒等購自武漢博士德生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 處理設計

隨機選取鴨傳染性漿膜炎血清抗體陰性的雛鴨21羽，攻毒組5羽，對照組2羽，每個處理設3個重復。攻毒組每羽雛鴨腿部肌肉注射1.0×1010CFU的鴨疫里默氏桿菌SG4株菌液，攻毒后觀察雛鴨發(fā)病和死亡情況。

1.2.2 樣品采集

將攻毒組病變明顯的雛鴨和對照組雛鴨頸動脈放血處死，摘取脾臟和法氏囊，固定于4%多聚甲醛溶液中備用。

1.2.3 組織學觀察

取脾臟和法氏囊，制作5 μm厚度石蠟切片，HE染色并在顯微鏡下觀察。石蠟切片脫蠟至水，進行免疫組化染色，制片并在顯微鏡下觀察，檢測TLR2、TLR4在鴨脾臟、法氏囊中的分布。

1.2.4 細胞因子檢測

用Trizol提取脾臟、法氏囊組織總RNA，反轉錄成cDNA作為PCR模板，根據(jù)GenBank檢索的TNF-α、IL-2、IL-6、IL-10、β-actin基因編碼序列設計引物(表1)，使用熒光定量試劑盒進行Real-time PCR。以β-actin基因為內(nèi)參，2-△△Ct定量細胞因子。

表1 基因編碼序列設計引物的信息

1.2.5 Western blot檢測鴨脾臟、法氏囊中TLR2、TLR4的表達

使用RIPA蛋白裂解液提取總蛋白，并用BCA蛋白含量檢測試劑盒檢測蛋白濃度，將各組蛋白濃度調(diào)至一致，加入蛋白上樣緩沖液，煮沸10 min后保存。取10 μL蛋白樣品進行Western blot試驗，將TLR2、TLR4抗體1∶1 000稀釋，以β-actin為內(nèi)參，檢測TLR2、TLR4蛋白的表達情況。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用GraphPad Prism軟件作圖，SPSS統(tǒng)計分析，單因素方差分析比較結果，P<0.05表示差異顯著，P<0.01差異極顯著，結果以平均值±標準誤表示。

2 結果與分析

2.1 免疫器官組織病理學變化

脾臟組織病理學變化見圖1。與對照組相比，攻毒組雛鴨脾臟腫大，表面有纖維素膜，呈現(xiàn)出大理石狀。脾臟紅髓充血、出血，竇顯著擴張、淋巴細胞排列散亂。脾臟白髓萎縮，淋巴細胞稀散，中央動脈內(nèi)皮細胞顯著腫脹，脾小體中淋巴細胞變性、壞死，細胞散亂，細胞間隙增加，組織結構疏松。

rp，紅髓；wp，白髓；sn，脾小體；ss，脾血竇；ca，中央動脈

法氏囊的組織病理學變化見圖2。攻毒組雛鴨法氏囊黏膜上皮嚴重破損，上皮微絨毛斷裂、脫落于管腔；淋巴濾泡皮質變薄，淋巴細胞減少，髓質細胞嚴重變性、壞死、溶解，濾泡中心出現(xiàn)大小不一的空泡，網(wǎng)狀細胞增多。許多淋巴細胞胞質、胞核濃縮，出現(xiàn)細胞退行性變化。

bn，腔上囊小結；co，皮質；me，髓質；*，空泡；→，粘膜上皮

2.2 TLR2、TLR4在鴨脾臟、法氏囊中的分布

TLR2、TLR4在鴨脾臟中分布見圖3～4。TLR4在鴨脾臟紅髓和白髓都有分布，且白髓主要分布于中央動脈周圍。當鴨感染傳染性漿膜炎后，與對照組相比較，TLR4分布于整個細胞質，白髓脾小體中出現(xiàn)TLR4，中央動脈周圍TLR4分布顯著增多。

如圖5所示，TLR2、TLR4主要分布于法氏囊的黏膜上皮和腔上囊小結。攻毒后，空泡化的腔上囊小結中分布大量的TLR4。

2.3 TLR2、TLR4在鴨脾臟、法氏囊中的表達

如圖6所示，TLR2在鴨脾臟中不表達。法氏囊中，各組TLR2表達量無顯著差異。TLR4在鴨脾臟中表達，攻毒后表達量顯著高于對照組；而在正常法氏囊中TLR4的表達量很低，但攻毒后極顯著的增加。

2.4 鴨攻毒后免疫器官中炎癥因子表達的變化

Real-time PCR檢測鴨攻毒后脾臟、法氏囊中TNF-α、IL-2、IL-6、IL-10等炎癥因子mRNA表達差異。結果(圖7)顯示：攻毒組與對照組相比，脾臟和法氏囊TNF-α、IL-2、IL-6顯著性的升高；而IL-10差異不顯著。

rp，紅髓；wp，白髓；sn，脾小體；ca，中央動脈

圖4 鴨脾臟TLR2分布定位

→，黏膜上皮；bn，腔上囊小結

**表示差異極顯著(P<0.01)。圖7同

圖7 鴨脾臟和法氏囊中炎癥相關因子的表達

3 討論

鴨傳染性漿膜炎是我國養(yǎng)鴨場常發(fā)、難以防治、造成養(yǎng)鴨業(yè)經(jīng)濟損失較為嚴重的傳染病之一。多年來，國內(nèi)外學者對鴨傳染性漿膜炎的流行病學、血清學分型、臨床診斷及防治等進行了較深入的研究[13-15]。然而，在疫苗免疫過程中，由于鴨疫里式桿菌血清型復雜，且不同血清型之間交叉保護缺乏，常導致免疫失敗[16]。當細菌、病毒等病原體感染動物機體時，先天性免疫是機體抵御入侵病原微生物的第一道防線。宿主細胞通過特定模式識別受體，識別不同類型的病原微生物，繼而激活一系列級聯(lián)信號通路，建立宿主的天然免疫反應[17]。模式識別受體中，Toll樣受體是比較重要的一種，禽類與哺乳動物這2類脊椎動物的Toll樣受體可識別相似的微生物產(chǎn)物。目前，在禽類疾病中相關的研究還很少[18-19]。本試驗對25日齡鴨人工感染傳染性漿膜炎強毒SG4株后，對鴨免疫器官脾臟和法氏囊的TLR2、TLR4的表達與分布定位進行研究。已有研究發(fā)現(xiàn)，LPS誘導炎癥可導致TLR4表達顯著增加[20]。當動物機體通過Toll樣受體識別病原微生物后，最終可通過多條信號通路誘導大量炎癥因子的表達，進而形成一系列炎癥反應[21]。本研究證明，鴨疫里默氏桿菌可誘導雛鴨免疫器官中TLR4表達顯著增高，攻毒組雛鴨免疫器官中主要是通過激活TLR4的內(nèi)吞作用繼而誘導TNF-α、IL-2、IL-6等炎癥因子的表達，繼而激活宿主天然免疫系統(tǒng)。以上結果提示，TLR4介導的信號通路在雛鴨抵抗病原菌感染中發(fā)揮重要作用。