胡媛媛，蔡賢雷，梅琨，王斯妤，Randy A Dahlgren,3*

(1.溫州醫(yī)科大學(xué) 浙南水科學(xué)研究院，浙江 溫州 325035； 2.浙江省流域水環(huán)境與健康風(fēng)險研究重點實驗室，浙江 溫州 325035；3.加州大學(xué)戴維斯分校 陸地、大氣與水資源系，美國 戴維斯 CA 95616)

平原河網(wǎng)地區(qū)河流縱橫交錯，人們往往沿河而居，居民的生產(chǎn)生活與水密切相關(guān)。伴隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展和城市化進(jìn)程的加快，平原河網(wǎng)地區(qū)水體納污量不斷增加，尤其是含氮物質(zhì)的大量流入，使河網(wǎng)水體的氮成為主要污染物之一，其污染與防治問題越來越受到廣泛關(guān)注。近些年來，水體中分布廣泛、代謝活躍的各類微生物成為研究的熱點[1]。研究表明，微生物在有機(jī)物的降解、生源要素的形態(tài)轉(zhuǎn)化和地球化學(xué)循環(huán)等方面發(fā)揮重要作用[2]，其中，自然界中氮的循環(huán)主要靠微生物驅(qū)動，比如氨氧化微生物可以驅(qū)動氨氧化反應(yīng)將水體中的氨氮氧化為亞硝氮，該反應(yīng)是硝化作用的第一步和限速步驟[3]，對河網(wǎng)水體中氮的消除和下游水體富營養(yǎng)化的控制具有重要作用。氨氧化反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用的是amoA基因編碼的功能酶——氨單加氧酶(ammonia monooxygenase, AMO)，其中的α亞基可以將NH3氧化成NH2OH[4-5]。近幾年來，有大量關(guān)于具有amoA基因的氨氧化細(xì)菌(AOB)和氨氧化古菌(AOA)的研究[6-10]。相關(guān)研究表明，AOB和AOA在不同環(huán)境中均有發(fā)現(xiàn)，且與不同環(huán)境因子呈現(xiàn)不同的相關(guān)關(guān)系，如pH值、營養(yǎng)鹽、溫度、鹽度等[11-12]。

水環(huán)境中的微生物，根據(jù)其生活方式的不同，可分為附著微生物和浮游微生物。而水體中的懸浮顆粒物作為水中微生物呼吸的熱點，其表面的附著微生物是有機(jī)質(zhì)降解、營養(yǎng)素循環(huán)過程中重要而直接的參與者[13]。因此，在平原河網(wǎng)這種嚴(yán)重富營養(yǎng)化、大型水生生物消亡的水環(huán)境中，對顆粒附著和浮游微生物中的氨氧化微生物進(jìn)行研究，可以使我們對平原河網(wǎng)的氮循環(huán)過程、生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的變化有更好的了解[14]。

溫瑞塘河作為典型的南方平原河網(wǎng)，為溫州市人口、經(jīng)濟(jì)和污染的聚集地，由于生活和工業(yè)污水的大量進(jìn)入，導(dǎo)致其水環(huán)境問題日益突出[15-17]。舜岙河發(fā)源于山澗溪流，隨后流經(jīng)村民生活聚集區(qū)，最后匯入河網(wǎng)，是溫瑞塘河一條典型的入河支流。在本研究中，我們以舜岙河為例，探究平原河網(wǎng)典型入河支流中AOB和AOA在顆粒附著與浮游微生物中的分布情況，并通過多元分析探究氨氧化微生物與環(huán)境因子的關(guān)系，這對深入了解平原河網(wǎng)氮循環(huán)過程、生態(tài)系統(tǒng)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況與樣品采集

采樣點位于浙江省溫州市溫瑞塘河茶山段的舜岙河(27°55′N，120°42′E)。該河源頭來自大羅山山澗溪流。上游水體為溪流形式，水淺、清澈，兩邊有村民種植的楊梅；沿上游往下為人為改造的幾個水潭，經(jīng)常有村民在此進(jìn)行洗衣、擦車等活動；向下進(jìn)入舜岙村居民區(qū)，兩岸均為民房；最后下游匯入平原河網(wǎng)，水面隨河道逐漸寬闊。我們從上游到下游依次隨機(jī)選取12個點作為采樣點，分別標(biāo)記為S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S11和S12(圖1)。其中，S1～S3分布于上游溪流形式的河道中，S4～S6分布于人為改造的水潭中，S7～S9分布于流經(jīng)居民區(qū)的河道中，S10～S12分布于下游匯入平原河網(wǎng)的河道中。于2017年4月11日，用采水器采集表層水樣，用多參數(shù)水質(zhì)測定儀YSI現(xiàn)場測定pH、水溫(T)、溶解氧(DO)、電導(dǎo)率(EC)等指標(biāo)。水樣冷藏于保溫箱中1 h內(nèi)運(yùn)回實驗室進(jìn)行后續(xù)分析。水體顆粒附著與浮游菌參照文獻(xiàn)[18-19]的膜過濾方法進(jìn)行分離與獲取，經(jīng)5 μm孔徑聚碳酸酯膜過濾，截留在濾膜上的微生物為顆粒附著菌；經(jīng)5 μm孔徑聚碳酸酯膜過濾的水樣，再經(jīng)0.2 μm孔徑聚碳酸酯膜過濾截留的為浮游菌。收集的樣品-20 ℃保存，用于后續(xù)的DNA提取和定量PCR分析。同時，樣品過濾之前，取10 mL水樣，5 μm孔徑聚碳酸酯膜過濾后再取10 mL過濾水樣，分別加入無顆粒甲醛(預(yù)先用0.2 μm濾膜過濾的分析純甲醛)進(jìn)行固定，使甲醛的終濃度≥2%，樣品-4 ℃冷藏，分別用于后續(xù)總菌與浮游菌的計數(shù)，并通過總菌減去浮游菌獲得顆粒附著菌數(shù)目。

圖1 研究點位的分布

1.2 指標(biāo)測定方法

1.2.1 水化學(xué)指標(biāo)的測定

1.2.2 細(xì)菌計數(shù)

取無顆粒甲醛固定的樣品，加入DAPI溶液(終濃度為1 μg·mL-1)，染色10 min后，采用手持式過濾泵，在真空壓力小于10 mm Hg下，過濾至孔徑為0.2 μm的黑背景聚碳酸酯膜上，滴加無熒光鏡油，于熒光顯微鏡(DM 4000B, Leica)100倍油鏡下對總菌和浮游菌進(jìn)行計數(shù)[21-22]。在紫外光的激發(fā)下，每個樣本隨機(jī)取20個視野計數(shù)。

1.2.3 DNA的提取與qPCR

采用FastDNA?Spin Kit for Soil對樣品進(jìn)行DNA提取，提取方法參照該試劑盒所提供的說明書進(jìn)行。參考Zeng等[23]的方法，分別以amoA-1F和amoA-2R[8]、Arch-amoAF和Arch-amoAR[10]為引物對氨氧化細(xì)菌amoA基因片段(491 bp)、氨氧化古菌的amoA基因片段(635 bp)進(jìn)行擴(kuò)增。分別以10倍梯度稀釋各重組質(zhì)粒，得到各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而根據(jù)qPCR結(jié)果計算出相應(yīng)的拷貝數(shù)。陰性對照、樣品和質(zhì)粒均為3個重復(fù)，qPCR的體系為20 μL∶10 μL 2×TransStart?Top Green qPCR Super Mix，上下游引物各0.4 μL，0.4 μL Passive Reference Dye(50×)，8.4 μL ddH2O，0.4 μL DNA模板。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析(one way ANOVA)和Duncan多重對比。圖表由Excel和Origin 8.0軟件進(jìn)行繪制。采用CANOCO 4.5軟件進(jìn)行主成分分析(PCA)和冗余分析(RDA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 水樣的基本理化性質(zhì)

表1 不同位點的水環(huán)境狀況

2.2 細(xì)菌計數(shù)與amoA基因豐度

12個位點中浮游態(tài)細(xì)菌豐度與附著態(tài)細(xì)菌豐度存在顯著差異(P<0.05)，浮游態(tài)細(xì)菌的豐度多于附著態(tài)細(xì)菌(圖2)。從浮游態(tài)和附著態(tài)微生物群體中AOB和AOA功能基因拷貝數(shù)均值來看，浮游細(xì)菌中AOB和附著細(xì)菌中AOB的豐度無顯著差異，浮游AOB豐度略高于附著AOB豐度，AOB豐度總體來說高于AOA。而浮游AOA豐度顯著(P<0.05)高于顆粒附著態(tài)AOA。

圖2 不同微生物豐度對比

2.3 氨氧化微生物豐度與環(huán)境因子之間的關(guān)系

將所得到的環(huán)境因子做主成分分析(PCA)，結(jié)果見圖3。圖中樣點之間的遠(yuǎn)近反映出不同點位水環(huán)境狀況的相異程度，點越近代表其環(huán)境因子的相似性越高，根據(jù)在PCA圖中的排序結(jié)果，大致可以得到4個分組，分別為S1～S3、S4～S6、S7～S9和S10～S12，分組情況與周邊環(huán)境的功能區(qū)大致吻合。而通過氨氧化微生物豐度進(jìn)行RDA分析，可以發(fā)現(xiàn)12個樣點同樣可以得到4個分組，與PCA結(jié)果相似。另外，通過RDA分析，可知總氮、氨氮、TOC對氨氧化微生物的豐度有較強(qiáng)的作用。

圖3 環(huán)境因子分布PCA分析與氨氧化微生物分布的RDA分析

3 小結(jié)與討論

采樣研究結(jié)果表明，受不同功能區(qū)影響舜岙河各處的水質(zhì)狀況差異顯著，從上游到下游水體有機(jī)污染逐漸加重。通過對水體微生物豐度進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)在非汛期，浮游態(tài)微生物豐度顯著高于顆粒附著態(tài)微生物豐度，浮游態(tài)氨氧化微生物豐度高于顆粒附著態(tài)氨氧化微生物豐度，其中氨氧化細(xì)菌豐度高于氨氧化古菌。經(jīng)PCA和RDA分析發(fā)現(xiàn)，環(huán)境因子對氨氧化微生物豐度和分布存在影響，其中總氮、氨氮、TOC是影響氨氧化微生物豐度和分布的主要環(huán)境因子。

微生物在不同環(huán)境中如海洋[24-25]、大型富營養(yǎng)化淡水湖[26-28]等典型生態(tài)環(huán)境的研究有很多，有結(jié)果表明，微生物的數(shù)量會隨著水中營養(yǎng)程度的遞增而升高[29]，因此，水中微生物的數(shù)量分布與動力學(xué)轉(zhuǎn)換緊密體現(xiàn)著水體水質(zhì)的狀況。黃瑾[30]在對太湖的研究發(fā)現(xiàn)，浮游態(tài)細(xì)菌豐度和多樣性的主要環(huán)境影響因子為氨氮、硝態(tài)氮和TSS等，在河口等營養(yǎng)程度較高的地區(qū)細(xì)菌豐度最高。本次研究的舜岙河是溫瑞塘河一條比較典型的入河支流，由于受到周圍不同環(huán)境的影響，其水質(zhì)狀況呈現(xiàn)一定規(guī)律性的變化，水體有機(jī)物、氨氮含量呈現(xiàn)增高的趨勢，將環(huán)境因子進(jìn)行PCA分析后形成了比較明顯的4個分區(qū)：其中位于平原河網(wǎng)入口處的S10～S12位點的總氮、氨氮和TOC等指標(biāo)濃度最高，為該河中營養(yǎng)程度最高的區(qū)域，不難推斷其原因，即平原河網(wǎng)水體受到沿岸生活、餐廚污物的影響較大，又因其流速較慢、納污能力較強(qiáng)，使其成為嚴(yán)重富營養(yǎng)化、有機(jī)物較多的水環(huán)境，因此，一些指標(biāo)普遍高于流速較快、水淺的上中游區(qū)域；其次為流經(jīng)居民生活區(qū)的S7～S9位點；而位于上中游的S1～S3和S4～S6位點處的污染程度較低。通過對微生物的豐度進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)浮游態(tài)和附著態(tài)微生物群體的豐度存在顯著差異，浮游態(tài)微生物豐度普遍高于附著態(tài)微生物，雖然采樣河道水深較淺，但采樣時天氣晴朗，山澗來水較少，底泥未見懸浮，水質(zhì)清澈，SS的測定結(jié)果也表明，水體懸浮顆粒物含量較低，尤其在舜岙河的上中游未匯入河網(wǎng)的河道中，因此，顆粒物含量較少可能是本研究中浮游態(tài)微生物豐度顯著高于附著態(tài)微生物的原因。

氨氧化微生物對平原河網(wǎng)水生態(tài)平衡、過量氮素的遷移轉(zhuǎn)化發(fā)揮著重要的作用。然而，作為氮循環(huán)的主要參與者，氨氧化微生物的豐度與分布亦受多種環(huán)境因子的影響[31]。研究結(jié)果顯示，舜岙河中氨氧化細(xì)菌受到周圍水環(huán)境的影響，進(jìn)行RDA分析后可將12個樣品大致劃分為4個分組，而這個分組與基于環(huán)境因子的PCA分析結(jié)果相似，間接表明環(huán)境因子的變化對氨氧化微生物的分布具有重要意義。通過RDA分析可知，在本研究中對氨氧化微生物存在主要影響的環(huán)境因子為總氮、氨氮和TOC。另外，對比AOB和AOA，發(fā)現(xiàn)AOB的豐度顯著高于AOA，許多研究表明，AOB的豐度隨著氨氮濃度的升高而增加，在氨氮含量較高的生態(tài)環(huán)境中AOB的豐度高于AOA[32-33]。本次研究中氨氮濃度從上游到下游逐漸升高，在位于居民生活區(qū)和匯入平原河網(wǎng)的河口處氨氮濃度較高，可能為AOB提供了適宜的生存環(huán)境，而12個位點的pH變化幅度較小，呈弱堿性，也有利于AOB類微生物展現(xiàn)硝化活性，以上原因可能導(dǎo)致在舜岙河中AOB較AOA為優(yōu)勢種群。將氨氧化微生物根據(jù)其生活類型分類后發(fā)現(xiàn)，無論是浮游態(tài)微生物中AOA還是AOB，其豐度均相應(yīng)的高于附著態(tài)微生物中的AOA和AOB，可能原因為研究時該河中浮游態(tài)微生物豐度較顆粒附著態(tài)微生物高，導(dǎo)致浮游態(tài)氨氧化微生物也相應(yīng)的多于附著態(tài)氨氧化微生物。