富昊偉，張紅梅，黃海明，馬興華，李友發(fā)

(1.嘉興市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 嘉興 314016； 2.嘉興市綠農(nóng)種子有限公司，浙江 嘉興 314000)

重金屬鎘對(duì)生物活性組織都有毒性，而且半衰期長(zhǎng)達(dá)10～30年。人吸收的鎘主要來(lái)自食物，大米作為中國(guó)人的主食，長(zhǎng)期食用鎘含量超標(biāo)的大米(中國(guó)國(guó)標(biāo)要求稻米中鎘含量低于 0.2 mg·kg-1)，對(duì)人類的健康會(huì)產(chǎn)生重大危害[1]。在鎘污染的土壤中種植的水稻，鎘會(huì)通過(guò)水稻的根吸收進(jìn)入莖稈和米粒之中，導(dǎo)致大米中的鎘含量增高，因此，鎘污染土地是生產(chǎn)“鎘毒大米”的根本原因。對(duì)鎘污染土壤的改良方法較多，如閑置多年不種植，使鎘自然衰減，或通過(guò)種植其他非糧食作物吸收，待土壤鎘含量達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)，再種植糧食作物。但這些方法都有較大的局限性，如閑置對(duì)耕地的浪費(fèi)在耕地短缺的我國(guó)就不適合國(guó)情，而種植其他非經(jīng)濟(jì)作物勢(shì)必減少農(nóng)戶收入[2]。從育種的角度，較理想的辦法是種植低鎘吸收的作物品種：即使在鎘污染的土壤中種植水稻，而產(chǎn)出的稻米中鎘的含量仍能達(dá)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。研究表明，水稻品種對(duì)鎘吸收存在差異性，篩選低鎘吸收的品種是有效的。但現(xiàn)在的育種實(shí)踐中，很少有將低鎘性狀作為育種目標(biāo)。這一方面可能是鎘的測(cè)定比較費(fèi)時(shí)、費(fèi)財(cái)，另一個(gè)原因也可能低鎘性狀和其他經(jīng)濟(jì)性狀如高產(chǎn)等有一定矛盾。但隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，對(duì)鎘吸收基因的功能研究日益清晰，利用生物技術(shù)獲得低鎘吸收種質(zhì)的可能性大大增加了。在本研究中，我們利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，對(duì)粳稻品系錫稻1號(hào)和甜粳1號(hào)編輯其鎘吸收相關(guān)的基因OsLCT1，獲得了3個(gè)低鎘吸收的突變體(突變體基因編輯及篩選過(guò)程將另文發(fā)表)。這3個(gè)品系均為粳稻品系，為明確低鎘吸收品系在產(chǎn)量和農(nóng)藝性狀與親本相比的差異性及在粳稻主栽區(qū)域的應(yīng)用前景，我們?cè)O(shè)計(jì)進(jìn)行了本試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料

參試材料為低鎘1號(hào)、低鎘2號(hào)、低鎘3號(hào)和錫稻1號(hào)、甜粳1號(hào)，以及嘉興市晚粳主栽品種秀水134。低鎘1號(hào)、低鎘2號(hào)為CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)編輯錫稻1號(hào)OsLCT1基因篩選獲得的突變體，低鎘3號(hào)為CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)編輯甜粳1號(hào)OsLCT1基因篩選獲得的突變體。突變體經(jīng)篩選定型，全基因組測(cè)序檢測(cè)，已不含任何轉(zhuǎn)基因成分。錫稻1號(hào)、甜粳1號(hào)，均系無(wú)錫哈勃有限公司經(jīng)花培育種選育的粳稻品系。

1.2 方法

進(jìn)行小區(qū)鑒定和大區(qū)品比試驗(yàn)，均以錫稻1號(hào)、甜粳1號(hào)和秀水134為對(duì)照品種(CK1、CK2和CK3)。

小區(qū)鑒定試驗(yàn)。采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，小區(qū)面積13.33 m2，重復(fù)3次。四周設(shè)3行以上保護(hù)行，種植對(duì)應(yīng)小區(qū)品種。田間肥水管理按當(dāng)?shù)厣a(chǎn)習(xí)慣統(tǒng)一操作。成熟時(shí)割除保護(hù)行后實(shí)收產(chǎn)量。

大區(qū)品比試驗(yàn)。3個(gè)鑒定品系和3個(gè)對(duì)照品種各種植200 m2，四周設(shè)同品種保護(hù)行，不設(shè)重復(fù)。田間肥水管理按當(dāng)?shù)厣a(chǎn)習(xí)慣統(tǒng)一操作。成熟時(shí)割除保護(hù)行后實(shí)收大區(qū)稻谷產(chǎn)量。

1.3 調(diào)查項(xiàng)目

農(nóng)藝性狀調(diào)查。在大區(qū)品比中完成。苗期及分蘗期調(diào)查試驗(yàn)品種及對(duì)照的落田苗、最高苗；穗期記栽始穗期、齊穗期、成熟期并計(jì)算全生育期；收獲前1 d取樣5株，調(diào)查有效穗、株高、穗長(zhǎng)、每穗實(shí)粒數(shù)、每穗總粒數(shù)、千粒重。

綜合性狀調(diào)查。記錄葉片形態(tài)、耐寒性、抗倒性、田間白葉枯病、稻瘟病、稻縱卷葉螟等各項(xiàng)表現(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)量

小區(qū)及大區(qū)測(cè)產(chǎn)結(jié)果見(jiàn)表1。低鎘1號(hào)和低鎘2號(hào)是從錫稻1號(hào)(CK1)獲得，小區(qū)平均產(chǎn)量分別為8.33、7.73 t·hm-2，比錫稻1號(hào)分別減產(chǎn)0.6%、7.8%。大區(qū)產(chǎn)量則低鎘1號(hào)比錫稻1號(hào)增產(chǎn)2.4%，低鎘2號(hào)減產(chǎn)4.1%。說(shuō)明低鎘1號(hào)的產(chǎn)量與親本接近(小區(qū)略減而大區(qū)略增)。但低鎘2號(hào)則小區(qū)和大區(qū)分別減產(chǎn)7.8% 和4.1%，減產(chǎn)達(dá)顯著水平。說(shuō)明即使對(duì)同一材料同一基因的編輯，獲得的突變品系產(chǎn)量也有差異。低鎘3 號(hào)是甜粳1號(hào)(CK2)的基因編輯篩選獲得，小區(qū)和大區(qū)產(chǎn)量與甜粳1號(hào)相比，分別減產(chǎn)2.3%、1.0%，均未達(dá)顯著水平，說(shuō)明獲得的低鎘3號(hào)產(chǎn)量水平也和親本接近。與嘉興主栽品種秀水134(CK3)相比，低鎘1號(hào)、2號(hào)及錫稻 1 號(hào)減產(chǎn)極顯著(減產(chǎn)幅度小區(qū)21.9%～28.0%，大區(qū)10.3%～14.0%)。減產(chǎn)幅度大的主要原因是生育期差異。低鎘3號(hào)與秀水134相比，小區(qū)產(chǎn)量減產(chǎn)2.6%，大區(qū)產(chǎn)量平產(chǎn)。顯然，就產(chǎn)量而言，低鎘3號(hào)在本試驗(yàn)的產(chǎn)量水平和秀水134相當(dāng)，較有競(jìng)爭(zhēng)力，而低鎘1號(hào)、2號(hào)與秀水134的產(chǎn)量水平減產(chǎn)幅度很大。

表1 3個(gè)水稻低鎘品系小區(qū)及大區(qū)試驗(yàn)產(chǎn)量表現(xiàn)

2.2 農(nóng)藝特性及田間長(zhǎng)勢(shì)

表2表明，低鎘1號(hào)、2號(hào)在嘉興屬于早熟晚粳類型，5月31日播種，8月23日始穗，10月6日已成熟可收割。與秀水134比，產(chǎn)量因子中，有效穗數(shù)增加，實(shí)粒數(shù)和千粒重明顯下降。以低鎘1號(hào)為例，有效穗增2.8%，實(shí)粒數(shù)-18.7%，千粒重-10.2%，理論產(chǎn)量-25.0%，和實(shí)際測(cè)產(chǎn)結(jié)果基本吻合。低鎘2號(hào)、低鎘3號(hào)經(jīng)測(cè)算也和實(shí)際測(cè)產(chǎn)結(jié)果吻合。從3個(gè)產(chǎn)量因子分析，低鎘品系與各自親本比，有效穗差異不顯著，結(jié)實(shí)率有顯著降低，千粒重有降低但不顯著。

表2 3個(gè)水稻低鎘品系生育期及主要經(jīng)濟(jì)性狀表現(xiàn)

從田間綜合長(zhǎng)相長(zhǎng)勢(shì)(表3)分析，低鎘1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)均青稈黃熟，抗倒伏。田間豐產(chǎn)性低鎘3號(hào)及親本甜粳1號(hào)和秀水134較好，與低鎘1號(hào)、2號(hào)及錫稻1號(hào)有明顯差別。試驗(yàn)田間未發(fā)現(xiàn)穗頸瘟、白葉枯病和紋枯病，這應(yīng)該和及時(shí)防治病害有關(guān)。

表3 3個(gè)水稻低鎘品系大田綜合長(zhǎng)勢(shì)長(zhǎng)相及田間抗性表現(xiàn)

3 小結(jié)與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，低鎘1號(hào)、2 號(hào)、3 號(hào) 3 個(gè)低鎘品種和親本比較，有效穗數(shù)略有增加，結(jié)實(shí)率和千粒重略有降低，理論產(chǎn)量總體上差別不大。即對(duì)低鎘基因OsLCT1編輯篩選到的低鎘1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)，基本保持了各自親本的農(nóng)藝特性和產(chǎn)量水平。表明對(duì)低鎘基因OsLCT1編輯可獲得對(duì)產(chǎn)量影響較小的低鎘突變體。

試驗(yàn)中低鎘3號(hào)產(chǎn)量水平較高，已達(dá)到主栽品種秀水134的水準(zhǔn)。表明突變體的產(chǎn)量水平和它的親本的產(chǎn)量水平高度相關(guān)。這給我們指出了應(yīng)用基因編輯技術(shù)獲得新種質(zhì)的思路，就是選擇當(dāng)?shù)刂髟云贩N，或比主栽品種更好的新品種(品系)用于基因編輯，這樣才會(huì)取得事半功倍的效果。

作為浙北糧倉(cāng)的嘉興市污染比較嚴(yán)重，嘉興市重金屬含量地理監(jiān)測(cè)系統(tǒng)(GIS)數(shù)據(jù)表明，重金屬綜合污染情況從輕到重分別為南湖、秀洲、平湖、海鹽、海寧、桐鄉(xiāng)、嘉善。因此，在嘉興市篩選低鎘吸收的水稻新品種，具有現(xiàn)實(shí)意義。