劉海英 張秋實 蘇旭明 張學(xué)新

河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院神經(jīng)外科 河北石家莊 050012

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的原發(fā)性腦腫瘤，具有高增殖性、浸潤性生長，易復(fù)發(fā)等特點，臨床治療效果較差[1]。惡性程度最高的膠質(zhì)瘤病人的中位生存期只有14.6 個月，5年生存率僅為9.8%。究其原因可能與膠質(zhì)瘤細胞的多形性、膠質(zhì)瘤干細胞的無限增殖以及多信號通路的共同激活有關(guān)[2]。因此，深入研究膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展的分子機制，尋找其發(fā)生發(fā)展的規(guī)律，探究腫瘤相關(guān)分子機制是治療膠質(zhì)瘤的一項重要手段。研究顯示SHH（Sonic Hedgehog）信號通路在胚胎發(fā)育尤其是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中起到重要作用。不僅如此近年來研究也證明，SHH 信號通路在多種腫瘤如髓母細胞瘤、胃癌、肝癌、基底細胞癌、肺癌、前列腺癌等的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[2-6]。

Shh 蛋白是SHH 信號通路的啟動因子，是一種由上皮細胞分泌的，具有高度保守性的分泌型糖蛋白[7]。以往的研究中顯示，其表達程度可直接反應(yīng)Shh 信號通路的激活狀況[6,9]。而在膠質(zhì)瘤中SHH 信號通路及Shh 蛋白的表達情況目前尚顯有報道。因此本研究旨在利用免疫組化技術(shù)，探究人腦膠質(zhì)瘤中SHH 信號通路中核轉(zhuǎn)錄因子Shh 蛋白的表達情況，探尋膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機制，為臨床實踐提供一定的幫助。

1 材料和方法

1.1 研究對象

收集我院神經(jīng)外科自2014年5月至2018年5月資料完整的行開顱手術(shù)患者腫瘤標本，經(jīng)病理證實為膠質(zhì)瘤標本75 例。其中男性39 例，女性36 例。年齡17-72 歲，中位年齡49.2 歲；病理學(xué)分級依據(jù)2016年WHO 中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類標準，分為四組：Ⅰ級13 例，Ⅱ級16 例，Ⅲ級21 例，Ⅳ級25 例。選取同期因腦外傷手術(shù)患者非腫瘤腦組織10 例作為對照組。

1.2 試劑

兔抗人Shh 單克隆抗體（Abcam 公司）、SP9001 免疫組化檢測試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)開發(fā)公司）。

1.3 免疫組織化學(xué)法檢測膠質(zhì)瘤及正常腦組織中Shh 的表達

將取得的膠質(zhì)瘤標本、非腫瘤腦組織經(jīng)甲醛溶液固定后，石蠟包埋切片，梯度復(fù)水后3%過氧化氫(H2O2)室溫避光孵育30min，PBS 沖洗2 次，EDTA 熱修復(fù)后PBS 沖洗2 次，血清封閉液37℃溫箱封閉1h，吸取多余血清后滴加一抗(shh 1:100)，4℃孵育過夜。次日PBS 沖洗2 次，加入生物素標記的二抗，37℃溫箱孵育30min，PBS 沖洗2 次，加鏈酶卵白素工作液，37℃溫箱內(nèi)孵育30min，PBS 沖洗2 次，DAB 顯色，復(fù)染。光鏡下觀察結(jié)果并拍照。

Shh 免疫組化表達均主要為細胞膜及細胞質(zhì)中。采用Friedrich 等 的 免 疫 反 應(yīng) 評 分（immunoreactivity score，IRS），采用半定量標準：高倍視野下隨機選取5 個視野，計數(shù)200 個細胞，陽性細胞≤10%為0 分；＞10%-50%為1 分；＞50%-75%為2 分；＞75%為3 分。染色強度標準：無色為0 分，淡黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分?？傮w評價：以上述2 項得分相乘：0 分判為“-”，1 分～4 分判為“+”，5 分～7 分判為“++”，≥8 分判為“+++”。以“++”和“+++”定義為陽性，“－”和“+”定義為陰性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，計數(shù)資料采用χ2檢驗或Fisher 確切概率法；組間比較采用非參數(shù)秩和檢驗。以P＜0.05 為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化結(jié)果

Shh 蛋白表達于膠質(zhì)瘤細胞胞膜、胞質(zhì)中。Shh 蛋白的表達在Ⅰ級膠質(zhì)瘤中為23.07%(3/13)，Ⅱ級37.50%(6/16)，Ⅲ級61.90%(13/21)，Ⅳ級76.00%(19/25)，正常腦組織中為10%（1/10），各膠質(zhì)瘤組與對照組比較具有顯著差異（P＜0.05）。

2.2 Shh 蛋白表達與膠質(zhì)瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系

Shh 蛋白表達與膠質(zhì)瘤患者的年齡、腫瘤大小、術(shù)前KPS 評分及是否為復(fù)發(fā)性腫瘤無關(guān)（P＞0.05）。Shh 蛋白的表達與膠質(zhì)瘤WHO 分級明顯相關(guān)，膠質(zhì)瘤各組間比較，隨腫瘤病理級別的增高，Shh 蛋白的表達逐漸增強，陽性率增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=29.054，P＜0.05）（表1）。

表1：膠質(zhì)瘤Shh 蛋白表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

3 討論

SHH 信號通路在普遍存在于正常的人體組織中，對于胚胎發(fā)育、細胞成熟、細胞分化、內(nèi)分泌激素的產(chǎn)生有著不可替代的重要作用。作為SHH 信號通路的啟動因子，當(dāng)shh 蛋白與Ptch 蛋白結(jié)合后，Smo 蛋白的抑制作用被解除，Gli 蛋白的水解作用被抑制，從而使Gli 蛋白以全長的形式進入細胞核，發(fā)揮其核轉(zhuǎn)錄因子的作用，促使靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯[8-10]。近年來，隨著研究的不斷深入，學(xué)者們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)SHH 信號通路在腫瘤組織中也有明顯的異常激活現(xiàn)象。

研究發(fā)現(xiàn)Shh 在原發(fā)性非小細胞肺癌中普遍存在，尤其與肺鱗癌的病理分化程度密切相關(guān)。而在小細胞肺癌中，Shh 和Gli-1的表達量明顯降低[11-13]。阿布拉等[14]等在胰腺癌研究中，發(fā)現(xiàn)SHH 信號通路中Shh、Ptch-1、Smo、Gli-1 在胰腺癌組織中表達量顯著高于胰腺癌旁組織及正常胰腺組織，證實SHH 信號通路在胰腺癌組織中存在異常活化現(xiàn)象；還有研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠活體中應(yīng)用Smo 抑制劑環(huán)靶明能夠誘導(dǎo)胰腺腫瘤細胞凋亡和減少腫瘤組織的形成，改善胰腺癌的預(yù)后[15]。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中，SHH 信號通路研究相對較少。研究發(fā)現(xiàn)，在部分髓母細胞瘤組織中存在SHH 信號通路的異?；罨F(xiàn)象。其中Ptch-1 的突變與人髓母細胞瘤的關(guān)系被廣泛證實[16]。何青蘭等[17]用RT-PCR 檢測體外培養(yǎng)的U251 惡性膠質(zhì)瘤細胞系及人腦膠質(zhì)瘤組織中SHH 信號通路因子mRNA 的表達，結(jié)果顯示在U251 細胞和膠質(zhì)瘤組織中的Shh mRNA 的表達分別高于其在瘤周組織的表達，提示Shh 的信號通路異常參與了腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展過程。Wang[18]等研究發(fā)現(xiàn)阻斷SHH 信號通路可限制膠質(zhì)瘤細胞的遷移和擴散。Shahi 等[19]研究發(fā)現(xiàn)Gli-1、Gli-3 mRNA 在大部分星形膠質(zhì)細胞瘤和髓母細胞瘤組織中呈明顯的高表達。

本實驗以SHH 信號通路中重要的啟動因子Shh 作為研究對象，應(yīng)用免疫組化的實驗方法發(fā)現(xiàn)10 例正常腦組織中Shh 不表達或僅有弱表達，而在75 例膠質(zhì)瘤組織中41 例檢測到Shh 陽性表達，余下34 例Shh 陰性表達，與對照組比較明顯增高，統(tǒng)計學(xué)分析有顯著差異，說明Shh 在膠質(zhì)瘤組織中呈高表達。在不同級別膠質(zhì)瘤間比較，Shh 在高級別膠質(zhì)瘤中陽性率明顯高于低級別組，有統(tǒng)計學(xué)意義。上述結(jié)果表明：與正常腦組織對比，在各級膠質(zhì)瘤組織中Shh 在蛋白水平均上調(diào)，提示Shh 信號通路在膠質(zhì)瘤細胞中是普遍激活的，隨腫瘤病理級別的增高，Shh 表達逐漸增強，有統(tǒng)計學(xué)意義。而Shh 的表達與膠質(zhì)瘤患者的年齡、腫瘤大小、術(shù)前KPS 評分及是否為復(fù)發(fā)性腫瘤無關(guān)。因此從另一個層面來說適時適當(dāng)干預(yù)Shh 的表達，調(diào)節(jié)Shh 信號通路的激活/失活狀態(tài)，將有可能作為治療膠質(zhì)瘤的一個重要手段。

目前有關(guān)SHH 信號通路在膠質(zhì)瘤方面的研究尚少，積極探究膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展的機制仍然有鎖欠缺，本研究樣本量較少，機制研究深入程度仍需完善，但也為臨床治療膠質(zhì)瘤提供了一定指導(dǎo)意義，為后續(xù)研究打下部分基礎(chǔ)。