張 哲 楊章武 葛 輝 杜秀萍 卓嚇晃 許智海

(1. 福建省水產(chǎn)研究所福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廈門(mén) 361013; 2. 廈門(mén)市廈興龍水產(chǎn)種苗有限公司，廈門(mén) 361026; 3. 福建省漳浦縣水產(chǎn)技術(shù)推廣站，漳州 363000)

凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei), 又稱(chēng)南美白對(duì)蝦, 原產(chǎn)于中南美太平洋海域, 目前是我國(guó)最重要的對(duì)蝦養(yǎng)殖品種, 養(yǎng)殖產(chǎn)量超過(guò)我國(guó)對(duì)蝦養(yǎng)殖總產(chǎn)量的85%, 福建是我國(guó)重要的凡納濱對(duì)蝦種苗生產(chǎn)基地, 蝦苗產(chǎn)量占全國(guó)的70%以上[1]。把生物絮團(tuán)技術(shù)應(yīng)用于凡納濱對(duì)蝦育苗生產(chǎn), 形成生態(tài)化規(guī)?；缂夹g(shù)工藝, 是防止濫用藥物、提高生物安全的重要技術(shù)手段。目前, 生物絮團(tuán)技術(shù)已普遍應(yīng)用在羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)[2]、羅非魚(yú)(Oreochromisspp)[3]、草魚(yú)(Ctenopharyngodon idella)[4]和鳙(Aristichthys nobilis)[5]等水產(chǎn)動(dòng)物的養(yǎng)殖中, 一些研究表明, 碳源的不同類(lèi)型可以影響生物絮團(tuán)的組成和大小[6,7]。不同的絮團(tuán)結(jié)構(gòu)也將影響其內(nèi)部聚集的菌群豐富度[8], 而保持菌群結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性對(duì)維持育苗水體生態(tài)平衡和水質(zhì)凈化能力具有重要意義[9,10]。在養(yǎng)殖水體中添加碳源, 在曝氣和水流的物理作用下, 會(huì)產(chǎn)生不同顆粒大小的絮團(tuán), 絮團(tuán)的顆粒過(guò)大不僅不利于蝦苗抱食, 而且會(huì)消耗水體過(guò)多的溶氧; 過(guò)小的絮團(tuán)顆粒, 則微生物群落較少[11], 且易于黏附在蝦苗體表, 影響其正常脫殼。因此, 在養(yǎng)殖水體中培育適宜大小的絮團(tuán)顆粒才能對(duì)蝦苗的生長(zhǎng)、存活、營(yíng)養(yǎng)組成及水質(zhì)凈化產(chǎn)生有益的影響。

目前, 在凡納濱對(duì)蝦育苗中添加不同碳源對(duì)培育生物絮團(tuán)大小的影響及其群落結(jié)構(gòu)與功能的研究尚少涉及。本研究以3種碳水化合物作為不同的添加碳源, 進(jìn)行生物絮團(tuán)技術(shù)育苗標(biāo)粗凡納濱對(duì)蝦苗實(shí)驗(yàn), 測(cè)定不同碳源培育的絮團(tuán)顆粒的大小, 并對(duì)3種生物絮團(tuán)中微生物進(jìn)行高通量測(cè)序, 比較其結(jié)構(gòu)和功能, 旨在探索凡納濱對(duì)蝦育苗生產(chǎn)中有效的生物絮團(tuán)技術(shù)措施, 以及為優(yōu)質(zhì)絮團(tuán)的篩選提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與條件

實(shí)驗(yàn)在福建廈門(mén)海滄區(qū)廈興龍水產(chǎn)種苗有限公司的種苗基地進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)養(yǎng)殖池為容積1.5 m3,深1.2 m的圓形玻璃鋼桶, 每池設(shè)置氣石4個(gè), 1 kW加熱棒及控溫儀1套(精確度為±1℃)。實(shí)驗(yàn)養(yǎng)殖對(duì)象為凡納濱對(duì)蝦蝦苗, 蝦苗材料是由廈興龍水產(chǎn)種苗公司生產(chǎn)的同一批無(wú)節(jié)幼體孵化而成, 體長(zhǎng)0.2—0.5 cm, 實(shí)驗(yàn)設(shè)3種碳源(葡萄糖、淀粉和蔗糖)進(jìn)行研究, 每組2個(gè)平行, 另設(shè)1個(gè)對(duì)照組, 每個(gè)養(yǎng)殖桶投放2×104尾P2仔蝦, 養(yǎng)殖20d, 養(yǎng)殖期間投喂蝦片等配合飼料(45%粗蛋白), 均購(gòu)自饒平縣永得利飼料有限公司, 每日投喂8次(每3h一次), 前期投餌量約2 g/m3, 后期增至3—5 g/m3, 根據(jù)水色、蝦苗密度等不同情況靈活調(diào)整。在投喂飼料后分別添加葡萄糖、淀粉、蔗糖和芽孢桿菌, 碳源添加量設(shè)定為每日投餌量的80%, 芽孢桿菌每3天添加1次, 每次添加量按1.5×105cfu/mL, 菌粉提前4h用海水活化, 然后均勻潑灑入池。對(duì)照組不添加任何碳源和芽孢桿菌, 按正常投喂進(jìn)行養(yǎng)殖。實(shí)驗(yàn)添加的碳源材料均購(gòu)自超市, 芽孢桿菌由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)院南海水產(chǎn)研究所研發(fā), 主要成分為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis), 菌含量1×1010cfu/g。

實(shí)驗(yàn)海水為海區(qū)抽取, 通過(guò)沉淀、砂濾、紫外滅菌處理后進(jìn)入養(yǎng)殖池, 實(shí)驗(yàn)期間保持水溫為28℃,鹽度26.5‰, 溶解氧＞5 mg/L, 水體持續(xù)均勻充氣, 使水體保持翻騰狀態(tài)。養(yǎng)殖池初始進(jìn)水600 L, 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行5日后每日加水30 L, 實(shí)驗(yàn)期間不排水。

1.2 水質(zhì)參數(shù)的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)期間, 每天測(cè)定溶解氧、pH; 每3天測(cè)定1次氨氮、亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮等水質(zhì)指標(biāo)。溶解氧采用哈希HQ30D便攜式溶氧儀測(cè)定, pH采用PHB-1型pH計(jì)測(cè)定; 水體氨氮、亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮濃度測(cè)定參照《海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范》, GB 17378.4-2007[12]。

1.3 生物絮團(tuán)收集與測(cè)定

實(shí)驗(yàn)期間, 每3天同一時(shí)間將1 L水樣加入英霍夫錐形管中測(cè)定絮團(tuán)體積, 取樣后20 min讀出積累在錐形管底部的絮狀物體積(單位mL/L)。在育苗第20天, 收集生物絮團(tuán), 利用60目篩網(wǎng)將養(yǎng)殖桶中的蝦苗分離, 之后將桶內(nèi)水體分別過(guò)300目篩網(wǎng), 所得過(guò)濾物置-20℃冰箱保存。

在養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí), 取各組收集的生物絮團(tuán)各1 g, 平行樣混合后在500 mL滅菌海水中混勻, 吸管取樣在生物顯微鏡(DH-2, Olympus)下觀(guān)察絮團(tuán)的形態(tài)結(jié)構(gòu), 隨機(jī)選取200個(gè)絮團(tuán)顆粒進(jìn)行長(zhǎng)度測(cè)定,測(cè)定其長(zhǎng)邊和短邊長(zhǎng)度, 取其均值作為絮團(tuán)顆粒的粒徑。

1.4 DNA提取、PCR擴(kuò)增及高通量測(cè)序

采用OMEGA公司的Soil DNA Kit試劑盒提取3種絮團(tuán)DNA, 平行組絮團(tuán)混合, 總計(jì)3個(gè)樣品。對(duì)提取后的DNA產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè), 然后用帶有barcode的特異引物擴(kuò)增16S rDNA的V3+V4區(qū)。引物序列為: 341F: 5′-CCTACGGGNGGCW GCAG-3′; 806R: 5′-GGACTACHVGGGTATCTA AT-3′。PCR反應(yīng)條件為: 95℃預(yù)變性2min, 隨后98℃ 變性10s, 62℃退火 30s, 68℃延伸30s, 共27個(gè)循環(huán), 最后68℃ 延伸10min。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收,用QuantiFluorTM熒光計(jì)進(jìn)行定量。將純化的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行等量混合, 連接測(cè)序接頭, 構(gòu)建測(cè)序文庫(kù),之后Hiseq2500 PE250上機(jī), 進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)優(yōu)化處理: 首先去除Miseq測(cè)序序列中帶有模糊N堿基的序列和低質(zhì)量序列。根據(jù)成對(duì)雙端片段(PE reads)之間的重疊關(guān)系, 將PE reads拼接為一條序列, 得到的拼接序列為原始標(biāo)簽(Raw Tags),Raw Tags經(jīng)過(guò)進(jìn)一步過(guò)濾處理[13], 得到高質(zhì)量的標(biāo)簽數(shù)據(jù)(Clean Tags): Raw Tags從連續(xù)低質(zhì)量值(默認(rèn)質(zhì)量閾值為≤3)堿基數(shù)達(dá)到設(shè)定長(zhǎng)度(默認(rèn)長(zhǎng)度值為3)的第一個(gè)低質(zhì)量堿基位點(diǎn)截?cái)? 經(jīng)過(guò)截取后得到的標(biāo)簽(Tags)數(shù)據(jù)集, 進(jìn)一步過(guò)濾掉其中連續(xù)高質(zhì)量堿基長(zhǎng)度小于Tags長(zhǎng)度75%的Tags[14]。然后與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)檢測(cè)嵌合體序列, 去除其中的嵌合體序列, 最終得到有效數(shù)據(jù)。

操作分類(lèi)單元(OTU, Operational Taxonomic Units)分析: 為了研究樣品的物種組成多樣性信息,用Uparse(usearch v9.2.64)軟件對(duì)所有樣品的全部有效序列(Effective Tags)進(jìn)行聚類(lèi), 默認(rèn)在97 %的相似性水平下將序列聚類(lèi)成為OTUs, 并計(jì)算出每個(gè)OTU在各個(gè)樣品中的標(biāo)簽序列絕對(duì)豐度和相對(duì)信息, Uparse構(gòu)建OTUs時(shí)會(huì)選取代表性序列(依據(jù)其算法原則, 篩選OTUs中豐度最高的序列)[15], 將代表序列比對(duì)參考數(shù)據(jù)庫(kù), 進(jìn)行各類(lèi)OTU分析。

物種分類(lèi): 主要通過(guò)RDP Classifier (http://rdp.cme.msu.edu/classifier/classifier.jsp)對(duì)各OTU代表序列進(jìn)行分類(lèi)。RDP classifier是基于Naive Bayesian方法的分類(lèi)工具, 它對(duì)每條序列在數(shù)據(jù)庫(kù)中每個(gè)分類(lèi)水平進(jìn)行匹配, 并計(jì)算匹配到某一水平的置信值(Confidence Threshold), 一般認(rèn)為置信值達(dá)到0.8為可信。再通過(guò)EzTaxon (http://www.ezbiocloud.net/identify)和/或NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)Blast程序進(jìn)一步修正分類(lèi)單元, 篩選出OTU序列最佳比對(duì)結(jié)果。統(tǒng)計(jì)各樣品在界(Domain)、門(mén)(Phylum)、綱(Class)、目(Order)、科(Family)、屬(Genus)水平上的分類(lèi)單元數(shù)。

菌群多樣性分析: 基于OTU的豐度結(jié)果, 應(yīng)用Mothur軟件計(jì)算Alpha多樣性指數(shù)中的豐富度(Chao1)、覆蓋率(Coverage)和多樣性(Simpson/Shannon)。同時(shí)利用R軟件生成不同分類(lèi)水平上(門(mén)、屬)的物種分布圖及樣本聚類(lèi)樹(shù)圖, 使用GraphlAn和iTOL軟件進(jìn)行分類(lèi)和系統(tǒng)發(fā)育可視化作圖。

Tax4Fun基因功能預(yù)測(cè): 16S高通量測(cè)序數(shù)據(jù)通過(guò)QIIME或SILVAngs平臺(tái), 基于SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)OTU進(jìn)行物種分類(lèi); 再根據(jù)NCBI的基因組注釋對(duì)16S拷貝數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化; 最后通過(guò)構(gòu)建SILVA分類(lèi)與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中原核分類(lèi)間的線(xiàn)性關(guān)系, 實(shí)現(xiàn)對(duì)菌群基因功能的預(yù)測(cè)。本文根據(jù)豐度排列前20的預(yù)測(cè)結(jié)果制作各組功能分布圖。

利用Excel數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理, 使用SPSS 18.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示,P＜0.05為差異性顯著。

2 結(jié)果

2.1 生物絮團(tuán)對(duì)育苗水質(zhì)的影響

3種碳源添加組及對(duì)照組中育苗水體pH無(wú)顯著差異(P＞0.05, 表 1); 不同實(shí)驗(yàn)組的溶解氧表現(xiàn)為:對(duì)照組＞淀粉組＞葡萄糖組＞蔗糖組, 其中對(duì)照組和淀粉組溶解氧分別與另二組差異顯著(P＜0.05), 葡萄糖組和蔗糖組差異不顯著; 不同組的氨氮、亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮總體表現(xiàn)為: 對(duì)照組＞淀粉組＞蔗糖組＞葡萄糖組, 淀粉組的氨氮、亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮的濃度分別為葡萄糖組的1.6、2.5和4.2倍和蔗糖組的1.3、1.9和3.0倍, 與這二組差異顯著(P＜0.05), 葡萄糖組和蔗糖組差異不顯著, 對(duì)照組氨氮、亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮的濃度分別為淀粉組的1.7、1.7和1.6倍, 與其他3組差異顯著(P＜0.05)。

表 1 添加不同碳源的生物絮團(tuán)對(duì)水質(zhì)指標(biāo)的影響Tab. 1 Effects of different carbohydrate sources on water quality

2.2 生物絮團(tuán)的變化與大小測(cè)定

經(jīng)過(guò)5—10d的培養(yǎng), 不同碳源組出現(xiàn)不同的水色。葡萄糖組水色呈現(xiàn)淡黃色, 淀粉組水色為橙黃色, 蔗糖組水色為棕色。實(shí)驗(yàn)期間, 生物絮團(tuán)的沉降體積隨時(shí)間延長(zhǎng)逐步增加(圖 1)。3個(gè)實(shí)驗(yàn)組生物絮團(tuán)生長(zhǎng)呈現(xiàn)剛開(kāi)始生長(zhǎng)緩慢, 培養(yǎng)7—9d后生物絮團(tuán)生長(zhǎng)迅速, 13—15d后, 沉降體積變化較小,趨于穩(wěn)定。

葡萄糖組絮團(tuán)形成較快, 實(shí)驗(yàn)1d和7d后絮團(tuán)體積增加較蔗糖和淀粉組分別多0.9和3.1 mL/L, 而第9天時(shí), 蔗糖組絮團(tuán)體積超過(guò)葡萄糖組, 且增加較葡萄糖組多1.3 mL/L, 后期蔗糖組與葡萄糖組絮團(tuán)體積差異慢慢增大。與葡萄糖和蔗糖組的生物絮團(tuán)相比, 淀粉組在養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)第5天后絮團(tuán)體積顯著小于其他兩組(P＜0.05)。

3種生物絮團(tuán)在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)大小測(cè)定結(jié)果如圖 2所示, 葡萄糖組、淀粉組和蔗糖組生物絮團(tuán)大小均值分別為(135.8±52.4)、(86.3±37.6)和(176.2±62.8) μm,粒徑大小呈現(xiàn): 蔗糖組＞葡萄糖組＞淀粉組。

2.3 微生物群落多樣性分析

圖 1 不同碳源組生物絮團(tuán)沉降體積的變化Fig. 1 Changes in biofloc volume with different carbohydrate sources throughout the experiment period

圖 2 三組絮團(tuán)的粒徑分布Fig. 2 Particle size distribution of flocs in three samples

圖 3 各組門(mén)水平菌群分布Fig. 3 Phylum distribution in each groups

表 2 三種生物絮團(tuán)微生物群落多樣性指數(shù)Tab. 2 Bacterial diversity in three samples

如表 2所示, 3種生物絮團(tuán)樣品分別測(cè)得553、515和542個(gè)OTU, 覆蓋率均在99%以上, 足夠檢測(cè)到大部分的微生物種系類(lèi)型。葡萄糖組群落分布豐度Chao1指數(shù)為594.6, 高于蔗糖組和淀粉組;Shannon指數(shù)越大代表多樣性越高, 各組絮團(tuán)多樣性依次為: 葡萄糖組(6.13)＞蔗糖組(5.89)＞淀粉組(5.42); 蔗糖組Simpson指數(shù)(0.913) 最高, 葡萄糖組次之, 淀粉組Simpson指數(shù)最低為0.652。

2.4 三種生物絮團(tuán)菌群結(jié)構(gòu)

三種生物絮團(tuán)門(mén)水平菌群分布3種類(lèi)型的生物絮團(tuán)在門(mén)級(jí)水平的細(xì)菌群落共有18余種(圖3),各組所含菌門(mén)主要是變形菌門(mén)(Proteobacteria)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)和浮霉菌門(mén)(Planctomycetes), 為各組優(yōu)勢(shì)菌門(mén)。淀粉組細(xì)菌門(mén)類(lèi)有11種,其中變形菌門(mén)(Proteobacteria)占38.3%, 擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)含量較葡萄糖組和蔗糖組分別高15.7%和25.3%; 蔗糖組細(xì)菌門(mén)類(lèi)有18種, 其中浮霉菌門(mén)(Planctomycetes)和放線(xiàn)菌門(mén)(Actinobacteria)含量高于葡萄糖組和淀粉組, 分別高出6.1%、12.7%和2.3%、2.5%。蔗糖組特有菌門(mén)SHA-109占比0.05%; 葡萄糖組細(xì)菌門(mén)類(lèi)有17種, 其中變形菌門(mén)(Proteobacteria)和擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)占比分別為42.7%和40.0%。葡萄糖組特有菌門(mén)Gracilibac-teria占比0.14%。還有Parcubacteria、Lentisphaerae、Spirochaetae等占比較少的菌門(mén)在蔗糖組和葡萄糖組中檢出, 淀粉組沒(méi)有。

圖 4 各組屬水平菌群分布Fig. 4 Genus distribution in each groups

三種生物絮團(tuán)屬水平菌群分布3種類(lèi)型的生物絮團(tuán)共包含210個(gè)菌屬, 各組占比前20位的菌群分布如圖 4所示。其中, 可鑒定的優(yōu)勢(shì)菌屬分別為Oceanicella、Planctomyces、Ruegeria、OM27_clade、Nitrosomonas、Kangiella和Muricauda, 各組的占比均超過(guò)1%。葡萄糖組中Oceanicella、Planctomyces和Ruegeria為優(yōu)勢(shì)菌屬, 其中Oceanicella屬占比最高為18.4%, 較淀粉組和蔗糖組分別高13.9%和8.5%;Ruegeria屬占比為5.1%, 較淀粉組高1%;Bacillus屬為投喂的地衣芽孢桿菌所在屬, 為3組中最高, 占比為0.92%, 較淀粉組和蔗糖組分別高0.4%和0.2%。淀粉組中Muricauda、OM27_clade、Cyclobacterium、Oceanicella屬為優(yōu)勢(shì)菌屬,其中差異較大的有Muricauda屬占比9.8%, 較葡萄糖組和蔗糖組分別高7.6%和7.8%;Cyclobacterium屬占比5.9%, 均高于葡萄糖組和蔗糖組。蔗糖組中Oceanicella、Planctomyces、Ruegeria、Rhodopirellula屬為優(yōu)勢(shì)菌屬, 其中Rhodopirellula屬具有較高占比, 較葡萄糖組和淀粉組分別高1.8%和4.1%。另外, 3組分別有35.3%、33.8%和36.3%的尚未鑒定菌屬。

菌屬分類(lèi)及系統(tǒng)發(fā)育如圖 5所示, 根據(jù)物種的分類(lèi)表達(dá)譜的數(shù)據(jù), 選取豐度大于1%的部分物種分類(lèi)單元, 制作了菌屬分類(lèi)進(jìn)化樹(shù), 將豐度靠前的菌門(mén)按不同的顏色標(biāo)出, 圈和星號(hào)大小代表物種豐度大小。

由圖 5可知, 菌門(mén)比例最大的為變形菌門(mén)(Proteobacteria), 包括Oceanicella、Ruegeria、OM27-clade、Nitrosomonas、Kangiella、Donghicola、Pseudospirillum及Sneathiella等菌屬。擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)為第二大菌門(mén), 包括Muricauda、Cyclobacterium、Portibacter等菌屬。Planctomyces、Rhodopirellula菌屬隸屬于浮霉菌門(mén)(Planctomycetes)。Mycobacterium、Illumatobacter菌屬隸屬于放線(xiàn)菌門(mén)(Actinobacteria)。Roseibacillus菌屬隸屬于疣微菌門(mén)(Verrucomicrobia)。

聚類(lèi)分析根據(jù)Unweighted Unifrac矩陣信息做UPGMA (Unweighted Pair-group Method with Arithmetic Mean)聚類(lèi)分析(圖 6), 葡萄糖組和蔗糖組聚為一類(lèi), 說(shuō)明葡萄糖組絮團(tuán)菌屬分布與蔗糖組絮團(tuán)菌屬分布相似。而淀粉組單獨(dú)聚為一類(lèi), 淀粉組絮團(tuán)菌屬分布與葡萄糖組和蔗糖組存在差異性。

2.5 Tax4Fun群落功能預(yù)測(cè)分析

Tax4Fun主要是通過(guò)構(gòu)建SILVA分類(lèi)與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中原核分類(lèi)間的線(xiàn)性關(guān)系, 實(shí)現(xiàn)對(duì)微生物群落功能的預(yù)測(cè)。結(jié)果獲得280個(gè)預(yù)測(cè)的功能, 豐度前20的功能如圖 7所示, 分別為ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(A)、雙組分系統(tǒng)(B)、嘌呤代謝(C)、氨酰生物合成(D)、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝(E)、嘧啶代謝(F)、精氨酸和脯氨酸代謝(G)、氮代謝(H)、卟啉和葉綠素代謝(I)、氧化磷酸化(J)、細(xì)菌分泌系統(tǒng)(K)、核糖體合成(L)、氨基糖和核苷酸糖代謝(M)、細(xì)胞周期(N)、淀粉和蔗糖代謝(O)、RNA降解(P)、果糖和甘露糖代謝(Q)、乙醛酸和二羧酸代謝(R)、鞭毛組裝(S)和甲烷代謝(T)。其中涉及氨基酸、核苷酸等新陳代謝功能的有12項(xiàng), 葡萄糖組、淀粉組、蔗糖組該類(lèi)功能基因豐度分別占比為22.2%、19.4%和21.8%; 涉及遺傳信息加工功能的3項(xiàng), 葡萄糖組該類(lèi)功能基因豐度最高為5.7%, 是淀粉組的1.12倍, 是蔗糖組的1.01倍; 發(fā)揮膜運(yùn)輸、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等環(huán)境信息處理功能的3項(xiàng), 占比最高的是葡萄糖組, 蔗糖組次之, 淀粉組最低, 基因豐度分別為18.8%、14.0%和16.9%; 還有2項(xiàng)功能存在于細(xì)胞周期中, 豐度最高組為蔗糖組, 葡萄糖組次之,淀粉組最低, 占比分別為2.6%、2.5%和2.9%。由圖可知3個(gè)實(shí)驗(yàn)組不同絮團(tuán)整體功能類(lèi)型相似, 但前20位的功能基因在葡萄糖組、淀粉組和蔗糖組群落中的豐度分別為49.3%、41.0%和47.2%, 其存在一定差異。

圖 5 菌屬分類(lèi)及系統(tǒng)發(fā)育Fig. 5 Classification and phylogenetic information

3 討論

3.1 不同碳源組生物絮團(tuán)對(duì)養(yǎng)殖水質(zhì)和菌群多樣性的影響

本研究表明, 不同碳源組生物絮團(tuán)對(duì)養(yǎng)殖水質(zhì)有顯著影響。結(jié)果顯示, 不添加碳源的對(duì)照組三氮指標(biāo)顯著高于碳源添加組, 在形成生物絮團(tuán)的養(yǎng)殖系統(tǒng)中, 應(yīng)用不同碳水化合物作為碳源產(chǎn)生的效果也不同[16], 淀粉組的水質(zhì)指標(biāo)要顯著高于葡萄糖組和蔗糖組, 可能是由于葡萄糖和蔗糖為單糖和二糖,淀粉為多糖, 單糖和二糖能夠較快的被絮團(tuán)中的細(xì)菌如硝化細(xì)菌、氨化細(xì)菌利用, 同時(shí)吸收水體中的氨氮、亞硝酸鹽等物質(zhì), 合成細(xì)菌自身蛋白物質(zhì)。而多糖則需要更多的時(shí)間分解為單糖, 才能被細(xì)菌利用, 從而導(dǎo)致氨化和硝化反應(yīng)較慢, 這可能造成淀粉組中的氨氮、亞硝酸鹽水平高于葡萄糖組和蔗糖組。這與Van[17]研究結(jié)果相符, 且添加碳水化合物可以降低水體里的氨氮和亞硝酸鹽氮濃度, 同時(shí)減少排放到環(huán)境中的氮[18], 說(shuō)明生物絮團(tuán)對(duì)氨氮的快速異養(yǎng)轉(zhuǎn)化的功能在水產(chǎn)養(yǎng)殖中具有重要意義。在本實(shí)驗(yàn)中, 3個(gè)實(shí)驗(yàn)組生物絮團(tuán)生長(zhǎng)過(guò)程先緩慢后快速, 最后平穩(wěn), 這與細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn)中遲緩期、對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期類(lèi)似[19], 實(shí)驗(yàn)第13至第15天后, 沉降體積趨于穩(wěn)定, 這與Xu等[20]研究結(jié)果吻合。另外, 在本研究中, 粒徑測(cè)量結(jié)果顯示, 淀粉組生物絮團(tuán)更為密集且顆粒較小, 而蔗糖組絮團(tuán)顆粒較大且孔隙較大, 粒徑大小呈現(xiàn): 蔗糖組＞葡萄糖組＞淀粉組。3種絮團(tuán)的微生物群落多樣性分析顯示,Chao1指數(shù)值在543.1—594.6, Shannon指數(shù)值在5.42—6.13, 說(shuō)明3組絮團(tuán)微生物群落的豐富度較高,Shannon指數(shù)越大, 豐富度越高。所得結(jié)果相似于夏耘等[21]采用PCR-DGGE技術(shù)分析草魚(yú)(Ctenopharyngodon idellus)養(yǎng)殖水體中生物絮團(tuán)情況。其中,葡萄糖組絮團(tuán)微生物群落表現(xiàn)出較高的豐富度和多樣性特征, 其粒徑大小約135.8 μm, 這表明, 在該粒徑范圍的絮團(tuán)具有較好的微生物生存環(huán)境, 例如適宜的好氧區(qū)、厭氧區(qū)比例, 有利于不同溶氧需求的微生物分布[22]。如菌屬分布中有好氧型Planctomyces、Nitrosomonas、Bacillus、Vibrio菌屬, 兼性厭氧型Arcobacter菌屬, 厭氧型Desulforhopalus、Thermotalea菌屬[23—27]。而粒徑大小約86.3 μm的淀粉組絮團(tuán), 其菌群多樣性較低, 推測(cè)原因?yàn)槠湫鯃F(tuán)體積較小, 菌群結(jié)構(gòu)測(cè)定結(jié)果顯示淀粉組絮團(tuán)專(zhuān)性好氧型菌屬占比約為36.7%, 而葡萄糖組和蔗糖組分別約為27.2%和29.5%, 淀粉組優(yōu)勢(shì)菌屬以好氧型居多, 其余類(lèi)型微生物分布和生長(zhǎng)可能受到限制,致使其Chao1和Shannon指數(shù)均最低。蔗糖組絮團(tuán)顆粒雖然最大, 具有更多的內(nèi)部空間結(jié)構(gòu), 但由于其內(nèi)部孔隙較多, 易被雜質(zhì)堵塞, 導(dǎo)致物質(zhì)傳輸受阻, 部分營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供給不足, 造成菌群退化和死亡,Chao1和Shannon指數(shù)也會(huì)相應(yīng)降低[11]。研究結(jié)果表明, 不同粒徑大小的絮團(tuán)顆粒具有不同的菌群多樣性, 在育苗生產(chǎn)中培育適宜粒徑大小的絮團(tuán)顆粒對(duì)于保持系統(tǒng)菌群多樣性具有重要作用。

圖 6 三組生物絮團(tuán)樣本菌群的聚類(lèi)分析Fig. 6 Cluster analysis of microflora in three biofloc samples

圖 7 Tax4Fun基因功能預(yù)測(cè)分布Fig. 7 Prediction distribution of Tax4Fun gene function

3.2 不同碳源組生物絮團(tuán)對(duì)菌群結(jié)構(gòu)的影響

在本研究中各組菌門(mén)分布顯示, 變形菌門(mén)(Proteobacteria)和擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)是各組的優(yōu)勢(shì)菌, 變形菌門(mén)和擬桿菌門(mén)在各組中分別占比達(dá)(38.3%—45.0%)和(49.6%—27.8%)。這與Xue等[28]通過(guò)DGGE研究對(duì)蝦苗池優(yōu)勢(shì)菌群特征相似。葡萄糖組和蔗糖組中浮霉菌門(mén)(Planctomycetes)比例較淀粉組分別大6.8%和15.1%。變形菌門(mén)(Proteobacteria)被認(rèn)為是水產(chǎn)養(yǎng)殖中的共生菌[29], 而變形菌門(mén)(Proteobacteria)和浮霉菌門(mén)(Planctomycetes)都具有去除污水中有機(jī)物的作用[30,31], 尤其是在生物絮團(tuán)的污水處理中, 變形菌門(mén)(Proteobacteria)在細(xì)菌組成中占支配地位[32]。所以生物絮團(tuán)應(yīng)用于養(yǎng)殖生產(chǎn)時(shí), 能有效調(diào)節(jié)養(yǎng)殖池水水質(zhì)。擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)普遍存在于海洋環(huán)境中, 其下屬的鞘脂桿菌綱具有降解不同生物高分子如纖維素、幾丁質(zhì)與果膠質(zhì)的能力[33], 可以快速降解幼體脫下的甲殼; 另外本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到的黃桿菌科也屬于擬桿菌門(mén), 該科多數(shù)種類(lèi)能水解碳聚合物和蛋白質(zhì)等有機(jī)物, 同時(shí)消耗水體中過(guò)量的氮和磷[34], 因此, 擬桿菌門(mén)對(duì)維持育苗水體生態(tài)系統(tǒng)平衡具有重要作用?？傮w來(lái)看, 在凡納濱對(duì)蝦育苗養(yǎng)殖中, 添加碳源可提高系統(tǒng)中微生物群落的豐富度, 包括變形菌門(mén)(Proteobacteria)、放線(xiàn)菌門(mén)(Actinobacteria)及厚壁菌門(mén)(Firmicutes)等菌群的比例。系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu)隨添加碳源的不同會(huì)發(fā)生一定的變化, 關(guān)于不同微生物利用碳源的方式以及有益菌和致病菌的比例控制還需進(jìn)一步研究。在屬水平上, 各組呈現(xiàn)較大差異, 水體菌群最優(yōu)勢(shì)的為Oceanicella屬。該屬菌群多為溫和嗜鹽種類(lèi), 在碳和硫元素循環(huán)過(guò)程中起重要作用, 同時(shí)會(huì)產(chǎn)生多種次生代謝活性物質(zhì)[35], 具有高效積累聚羥基烷酸(Polyhydroxyalkanoate, PHA)的能力[36]。在各組中還有3個(gè)已知屬(Donghicola、Nautella、Marivita)和Oceanicella同隸屬于紅桿菌科, 是其重要的分支, 普遍存在于海水環(huán)境中, 其豐度之和在3組中分別高達(dá)20.4%、8.8%和11.6%, 表明紅桿菌科在育苗水體中呈顯著優(yōu)勢(shì)。其中,Nautella和Marivita都是溫和嗜鹽或耐鹽菌, 大多化能異養(yǎng)[35]; 關(guān)于Donghicola相關(guān)功能報(bào)道較少, Xue等[28]通過(guò)DGGE研究發(fā)現(xiàn),Donghicolasp.在凡納濱對(duì)蝦正常苗池中也具有優(yōu)勢(shì)。除此之外,Planctomyces與Rhodopirellula也是相對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬, 這2個(gè)屬都屬于浮霉菌門(mén), 均為海水中高豐度類(lèi)群[37]。Planctomyces多數(shù)種類(lèi)是化能異養(yǎng), 可利用碳?xì)浠衔镞M(jìn)行發(fā)酵作用[38]。Rhodopirellula具有碳化合物合成相關(guān)途徑, 可固定二氧化碳[39,40], 屬于化能自養(yǎng)型的厭氧氨氧化細(xì)菌。另外, 擬桿菌門(mén)的Muricauda也是相對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬,Muricauda可產(chǎn)生多種胞外酶分解利用復(fù)雜碳源[41], 同時(shí)水解產(chǎn)生的簡(jiǎn)單碳水化合物可為菌群移除水體過(guò)量N、P提供碳源[34]。在各組鑒定菌屬中, 還有Ruegeria、OM27_clade、Nitrosomonas和Kangiella為優(yōu)勢(shì)菌屬, 豐度均≥1.0%, 在上述菌屬的協(xié)同作用下, 各組生物絮團(tuán)能有效調(diào)控水質(zhì), 在不排水的情況下, 使三氮濃度維持較低水平, 育苗水體生態(tài)系統(tǒng)保持相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)。關(guān)于優(yōu)勢(shì)菌群在育苗水體中高豐度存在機(jī)制及生態(tài)位功能還需進(jìn)一步研究。

3.3 不同碳源組生物絮團(tuán)對(duì)菌群基因功能的影響

養(yǎng)殖水體中菌群結(jié)構(gòu)和多樣性對(duì)水質(zhì)和養(yǎng)殖生物安全都有很大影響。研究表明, 弧菌病和絲狀細(xì)菌病常見(jiàn)于對(duì)蝦幼體育苗過(guò)程中, 其主要病原菌來(lái)自水體環(huán)境中的弧菌屬(Vibrio)和亮發(fā)菌屬(Leucothrix)等, 導(dǎo)致幼體脫殼緩慢, 附肢斷裂, 是水體中常見(jiàn)的病原菌[42,43]。同時(shí), 養(yǎng)殖水體中也存在大量中性和有益菌群, 它們?cè)谖镔|(zhì)循環(huán)、生物合成、維持水體生態(tài)平衡等方面起著重要作用[44]。由此可見(jiàn), 水體菌群會(huì)直接或間接的影響對(duì)蝦幼體生長(zhǎng)過(guò)程。通過(guò)Tax4fun基因功能預(yù)測(cè), 各組樣品OTU基因表達(dá)與細(xì)胞生長(zhǎng)分裂等生命活動(dòng)密切相關(guān), 如N、S等, 這表明, 在生物絮團(tuán)內(nèi)部存在旺盛的生命活動(dòng), 例如各種物質(zhì)的新陳代謝, 如C、F、E、G,本文中同樣檢測(cè)到較高豐度的碳水化合物代謝基因, 如M、O、Q、R。生物絮團(tuán)組分之一的胞外聚合物(Extracellular Polymeric Substances, EPS)主要由多種細(xì)菌分泌的蛋白質(zhì)、核酸、多糖多肽等組成, 結(jié)果檢測(cè)有較高A、B、K基因豐度, 這些基因可能與胞外聚合物的運(yùn)輸和形成密切相關(guān)。EPS不僅是對(duì)蝦生長(zhǎng)很好的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充, 而且能幫助絮團(tuán)凝聚及凈化水質(zhì)。鄧吉朋等[45]將生物絮團(tuán)應(yīng)用于斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeus monodon)養(yǎng)殖中, 顯著提高了斑節(jié)對(duì)蝦的特定生長(zhǎng)率和存活率。阮曉東等[46]研究了絮團(tuán)在吸附污染物過(guò)程中, 緊密型胞外聚合物發(fā)揮主要作用。結(jié)果表明, 絮團(tuán)內(nèi)部菌群代謝旺盛, 部分菌群的代謝產(chǎn)物對(duì)于水質(zhì)凈化具有很好的促進(jìn)作用。通過(guò)Tax4Fun預(yù)測(cè)顯示, 3種生物絮團(tuán)基因功能相似, 但在各組中的豐度水平存在差異, 這與各組菌群的種類(lèi)和數(shù)量相關(guān), 結(jié)果與菌群多樣性和豐度數(shù)據(jù)基本吻合。

4 結(jié)論

通過(guò)向凡納濱對(duì)蝦育苗水體中添加碳源, 形成生物絮團(tuán), 可有效調(diào)節(jié)水質(zhì), 降低水體中三氮水平,其中, 葡萄糖組和蔗糖組效果較好, 淀粉組次之。菌群多樣性分析結(jié)果表現(xiàn)為葡萄糖組＞蔗糖組＞淀粉組, 這與絮團(tuán)大小、菌群組成和占比有關(guān); 在門(mén)級(jí)水平上, 3種絮團(tuán)菌群種類(lèi)和占比存在差異性, 葡萄糖組和蔗糖組在門(mén)級(jí)種類(lèi)上顯著高于淀粉組; 在屬水平上, 3種絮團(tuán)菌群種類(lèi)相似, 但優(yōu)勢(shì)菌屬占比存在差異。Tax4Fun群落功能基因預(yù)測(cè)分析結(jié)果顯示, 葡萄糖組在細(xì)胞新陳代謝、遺傳信息加工和環(huán)境信息處理等方面功能基因在本組的豐度均高于蔗糖組和淀粉組, 說(shuō)明葡萄糖組生物絮團(tuán)內(nèi)部菌群生命活動(dòng)更加活躍。