陳紅菊 王 慧 孔維祎 許高朋 王曉云 趙 燕 季相山

(1. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)山東省動(dòng)物生物工程與疾病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 泰安 271018; 2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)(煙臺(tái))海洋學(xué)院, 煙臺(tái) 264000)

在水產(chǎn)養(yǎng)殖中, 投入水體中的飼料只有約25%的蛋白被水產(chǎn)動(dòng)物吸收利用, 多數(shù)飼料蛋白通過(guò)糞便、殘餌、分泌物等形式重新流失到水體中[1,2],造成含氮有機(jī)物在水體中累積, 當(dāng)這些有機(jī)物過(guò)多,難以被天然的微生物完全分解時(shí), 便造成了水質(zhì)惡化, 從而引發(fā)水體缺氧、水生動(dòng)物發(fā)病甚至死亡等一系列后果。因此, 人為地施加能高效分解殘餌、糞便等有機(jī)物的微生物菌種是非常有必要的[3]。為了將大的有機(jī)物分解掉, 施加的菌株最好是復(fù)合菌,從功能上分主要包含2大類, 第一類是能將大的有機(jī)物分解為氨氮等小分子有機(jī)物的菌株; 第二類是將氨氮等進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為氮?dú)獾葰怏w的菌株?？莶菅挎邨U菌(Bacillus subtilis)具有強(qiáng)大的產(chǎn)酶系統(tǒng), 在其生長(zhǎng)繁殖期間, 特別是在穩(wěn)定期能夠分泌大量的中性蛋白酶、堿性蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、植酸酶等數(shù)十種酶[4], 可將殘餌、糞便等有機(jī)物分解為氨氮等小分子物質(zhì), 主要行使第一類菌的功能。為了提高枯草芽孢桿菌等分解大分子有機(jī)物的能力, 人們多從提高其酶活性方面開(kāi)展相關(guān)研究,如通過(guò)紫外誘變等手段篩選和培育高產(chǎn)酶活性的枯草芽孢桿菌等[5,6]。蔡婉玲等[7]利用紫外誘變使菌株產(chǎn)蛋白酶活性提高了15.6%。本實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)紫外誘變的方法獲得了能穩(wěn)定遺傳的高產(chǎn)蛋白酶活性的突變菌株B38, 其降解飼料中可溶性蛋白的能力提高了2.57倍[8]。

氨氮等進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為氮?dú)獾葰怏w的過(guò)程較為復(fù)雜, 需要經(jīng)過(guò)氨氧化、硝化、反硝化等眾多途徑,中間會(huì)形成硝酸鹽、亞硝酸鹽、一氧化二氮等中間產(chǎn)物[9], 一般需要一個(gè)或多個(gè)菌株的共同參與才能完成。前期人們已篩選了大量的降解氨氮的菌株[9—12], 但從養(yǎng)殖水體和底泥中直接篩選降解氨氮菌株的報(bào)道并不多。

本研究在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上, 為了進(jìn)一步提高水體中含氮有機(jī)物分解效果, 擬從多種水產(chǎn)動(dòng)物的養(yǎng)殖池塘中篩選出高效的氨氮降解菌, 優(yōu)化其培養(yǎng)條件, 并通過(guò)灌服試驗(yàn)檢測(cè)其對(duì)養(yǎng)殖生物的安全性。再將篩選菌株與B38[8](能分解飼料蛋白的枯草芽孢桿菌)復(fù)配后制成復(fù)合菌, 通過(guò)養(yǎng)殖試驗(yàn)與4種商品微生態(tài)制劑(光合細(xì)菌、酵母菌、強(qiáng)效EM和芽孢桿菌)進(jìn)行比較, 評(píng)價(jià)復(fù)合菌液在水質(zhì)調(diào)控方面的效果, 為復(fù)合型微生態(tài)制劑的開(kāi)發(fā)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

菌株: 用于篩選菌株的樣品取自泰安、濟(jì)寧和南寧的多處養(yǎng)殖池塘或自然水體(表 1), 共計(jì)82份。試驗(yàn)用魚(yú): 黃河鯉(10—12 cm)、鰱、鳙(8—10 cm)取自泰安市水產(chǎn)研究所。

光合細(xì)菌、酵母菌和強(qiáng)效EM由山東寶來(lái)利來(lái)生物工程股份有限公司惠贈(zèng); 芽孢桿菌購(gòu)自廣州利洋水產(chǎn)科技股份有限公司。

1.2 菌株的分離鑒定

菌株的篩選與評(píng)價(jià) 采集的水樣不做處理,可直接作為樣品液使用。對(duì)采集的泥樣做以下處理: 分別稱取1 g泥樣加入到裝有9 mL無(wú)菌生理鹽水的離心管中, 30℃振蕩活化30min, 靜置15min后取上清液, 由此制得泥樣懸浮液。采用定向富集分離法對(duì)采集的樣品進(jìn)行菌株富集分離[13]。將樣品以1%的接種量接種到初始氨氮濃度為50 mg/L的高濃度氨氮培養(yǎng)基中, 進(jìn)行連續(xù)6次的富集馴化培養(yǎng),每次的馴化周期為3天。在馴化結(jié)束后采用平板劃線法分離篩選菌株, 共篩選出9株, 劃線純化3代后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表 1 采集樣品相關(guān)信息Tab. 1 Sample information

將分離得到的9株耐受基礎(chǔ)菌株搖菌后制成A600為1的菌液, 分別接種到裝有20 L水的容器中,接種量終濃度為107個(gè)/mL, 氨氮初始濃度為50 mg/L。試驗(yàn)用水進(jìn)行曝氣、充氧, 每隔24h測(cè)定水體的氨氮濃度, 測(cè)定3次。

菌株的鑒定形態(tài)學(xué)觀察: 將xh1和xh7用革蘭氏染色法染色后, 依照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[14]對(duì)細(xì)菌種類進(jìn)行初步鑒定。

生理生化鑒定: API 50CHE 試驗(yàn)條和apiweb-API 50CHBV3.0 分析鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)(BioMérieux公司)、BioNumerics生物分析軟件(Applied Maths公司)對(duì)xh1和xh7進(jìn)行生理生化鑒定[15]。

以菌液為模板進(jìn)行16S rDNA 部分序列的PCR擴(kuò)增, 引物為: 5′-AGAGTTTGATCMTGGC TGAG-3′, 5′-TACGGYTACCTTGTTACGAGTT-3′。PCR擴(kuò)增程序: 94℃預(yù)變性4min, 94℃變性30s,56℃復(fù)性45s, 72℃延伸90s, 35個(gè)循環(huán)后72℃延伸7min, 4 ℃保存。選取陽(yáng)性克隆測(cè)序, 所得序列進(jìn)行Blast比對(duì), 利用MEGA5.05軟件構(gòu)建進(jìn)化樹(shù), 對(duì)菌株進(jìn)行分子鑒定。

1.3 菌株培養(yǎng)條件的優(yōu)化

篩選得到的xh1和xh7菌株菌懸液分別接種于優(yōu)化培養(yǎng)基, 進(jìn)行單因素的條件優(yōu)化, 即在優(yōu)化一個(gè)條件時(shí), 其他條件保持不變(溫度30℃, C/N 15,pH7.0, 鹽度0)。200 r/min振蕩培養(yǎng), 24h后測(cè)定菌液A600值。

溫度梯度設(shè)置: 20℃、25℃、30℃、35℃、40℃。

pH設(shè)置: 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5。

鹽度梯度設(shè)置: 0、3‰、5‰、10‰、20‰、30‰。

C/N梯度設(shè)置: 2、5、10、15、20[16]。

1.4 菌株的安全性檢測(cè)

選取相同養(yǎng)殖環(huán)境、相同日齡、體重(50±2.48) g的黃河鯉660尾, 平均分為11組, 每組3個(gè)重復(fù)。暫養(yǎng)一周后進(jìn)行試驗(yàn)。第1組灌服無(wú)菌生理鹽水作為對(duì)照組。第2至第6組灌服不同濃度的xh1菌液, 第7至第11組灌服不同濃度的xh7菌液, 菌液濃度分別為105、106、107、108和109cfu/mL。每尾試驗(yàn)魚(yú)灌服劑量為0.5 mL, 連續(xù)灌服3d, 觀察時(shí)間為14d, 相同條件飼養(yǎng), 觀察攝食能力及行動(dòng)狀態(tài), 統(tǒng)計(jì)14d內(nèi)的累計(jì)死亡率。

1.5 復(fù)合菌與四種商品微生態(tài)制劑對(duì)水質(zhì)調(diào)控效果的評(píng)價(jià)

復(fù)合菌的配制: xh1、xh7是本研究篩選出的2個(gè)高效氨氮降解菌, B38是本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)誘變篩選得到的高產(chǎn)蛋白酶的菌株[8]。將xh1、xh7和B38培養(yǎng)至109個(gè)/mL時(shí), 離心濃縮后以1∶1∶1的比例復(fù)配成復(fù)合菌。

試驗(yàn)設(shè)計(jì): 共設(shè)置5個(gè)試驗(yàn)組(分別潑灑復(fù)合菌、光合細(xì)菌、酵母菌、強(qiáng)效EM菌、芽孢桿菌)和2個(gè)對(duì)照組(不潑灑益生菌), 其中1個(gè)對(duì)照組正常投喂飼料, 另1個(gè)不投喂飼料, 所有試驗(yàn)組都投喂飼料。試驗(yàn)用益生菌在潑灑前均用梯度稀釋法進(jìn)行菌種計(jì)數(shù), 菌液潑灑終濃度為107個(gè)/L。每組3個(gè)池塘重復(fù)。各組池塘中飼養(yǎng)鯉、鰱和鳙, 鯉放養(yǎng)密度為(207±7.58) g/m3, 鰱和鳙放養(yǎng)比例為3∶1, 放養(yǎng)密度為(57±3.24)g/m3, 日投餌量為魚(yú)體重的4%—5%, 試驗(yàn)期間每個(gè)池塘投餌量都一致, 日投餌量120 g。試驗(yàn)所用池塘初始水體積為8 m3, 調(diào)節(jié)各池塘的水體初始pH為7.5, 試驗(yàn)水溫控制在25—30 ℃。向各水體內(nèi)添加NH4Cl溶液, 調(diào)節(jié)水中初始總氨氮(TAN)濃度至6 mg/L。在試驗(yàn)過(guò)程中, 選取不同時(shí)間點(diǎn)取樣, 測(cè)定各項(xiàng)水質(zhì)指標(biāo)。氨氮、亞硝態(tài)氮測(cè)定的取樣時(shí)間為:0(加入微生態(tài)制劑后的6h)、1d、5d、9d、11d和18d, 藻類測(cè)定的取樣時(shí)間為: 0 (加入微生態(tài)制劑后的6h)、5d、9d和14d。

總氨氮的測(cè)定: 采用納氏試劑法[17]測(cè)定。計(jì)算公式:ρ=A水樣/b×25.0/V水樣

亞硝態(tài)氮的測(cè)定: 采用重氮偶合分光光度法測(cè)定。

藻類數(shù)量的測(cè)定: 采用濃縮沉淀法[18]測(cè)定。

1.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示, 用軟件Excel 2016和SPSS 21.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和顯著性檢驗(yàn)(P＜0.05)。

2 結(jié)果

2.1 氨氮降解菌的篩選、培養(yǎng)條件優(yōu)化與安全性檢測(cè)

氨氮降解菌的篩選本試驗(yàn)共采集82份樣品(表 1), 采用定向富集分離法篩選高效降解氨氮的菌株, 共篩選出9株菌株, 命名為xh1-xh9。這9株菌降氨氮效果評(píng)價(jià)試驗(yàn)顯示, 24h時(shí)xh1和xh7兩株菌對(duì)氨氮的降解率均達(dá)到90%以上。72h時(shí)xh1與xh7菌株的降解率分別達(dá)97.8%和98.5%。二者在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)氨氮的降解率均顯著高于其他菌株(表 2)。

表 2 篩選菌株氨氮降解率結(jié)果Tab. 2 Results of ammonia nitrogen degradation rate

菌株的鑒定結(jié)果顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn), 2個(gè)菌株胞體均呈桿狀, 能形成芽孢, 無(wú)鞭毛, 兩端鈍圓,單個(gè)或少數(shù)呈短鏈狀。經(jīng)革蘭氏染色均呈陽(yáng)性。依據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》將其初步鑒定為芽胞桿菌屬。

將培養(yǎng)好的菌液接種于API50 CH 芽孢桿菌鑒定試劑條, 得出該菌株的生理生化反應(yīng)譜。經(jīng)計(jì)算機(jī)軟件鑒定, xh1、xh7與凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)的相似度分別為99.6%與96.9%。

從篩選菌株基因組擴(kuò)增到長(zhǎng)度約1500 bp的16S rDNA序列, 在NCBI中BLAST比對(duì)結(jié)果顯示,xh1與xh7序列與凝結(jié)芽孢桿菌的相似性在99%以上。選取芽孢桿菌屬中的9株菌株序列信息, 與篩選菌株進(jìn)行序列分析, 以非典型弧菌(Vibrio atypicus, 登錄號(hào): JX867739)作為外類群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果顯示, xh1、xh7與凝結(jié)芽孢桿菌(登錄號(hào):NR_041523.1)聚為一類, 說(shuō)明篩選菌株與凝結(jié)芽孢桿菌的親緣關(guān)系最近(圖 1)。

菌株培養(yǎng)條件的優(yōu)化菌株培養(yǎng)條件優(yōu)化試驗(yàn)顯示, xh1和xh7兩株菌受pH的影響不大, 在微酸性、中性和微堿性環(huán)境下均能生長(zhǎng)良好。其中,xh1菌株的最適pH為7.5, xh7菌株的最適pH為7.0(圖 2A)。

在溫度低于35℃時(shí), 測(cè)得2株菌的A600隨溫度的升高而增大, 最適溫度應(yīng)該在35—40℃左右; 而溫度達(dá)到45℃時(shí), xh7菌株生長(zhǎng)稍受影響, xh1菌株的生長(zhǎng)狀況良好, 說(shuō)明xh1菌株耐高溫能力較xh7強(qiáng)(圖 2B)。

在低鹽度環(huán)境下, xh1菌株的生長(zhǎng)情況良好, 鹽度為10‰時(shí)生長(zhǎng)情況最佳; 鹽度高至30‰時(shí), 2株菌的生長(zhǎng)均受到一定程度的影響,A600值降至2以下。xh7菌株受鹽度變化的影響不大, 始終保持在A600值為2左右(圖 2C)?？傮w看來(lái), 在一定范圍內(nèi), 鹽度對(duì)復(fù)合菌的生長(zhǎng)情況影響不大。

隨著C/N的升高, xh1與xh7兩株菌A600值均升高, C/N為15時(shí)兩株菌生長(zhǎng)狀況最好, C/N為20時(shí)xh7菌株生長(zhǎng)稍受影響, 而xh1菌株依舊生長(zhǎng)良好(圖 2D)。

菌株安全性檢測(cè)在各個(gè)菌液灌服濃度下,黃河鯉的攝食能力和行動(dòng)狀態(tài)均正常, 均未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象, 與灌服生理鹽水的對(duì)照組無(wú)差異(表 3)。結(jié)果表明菌液是安全的, 可以用于生產(chǎn)實(shí)踐。

圖 2 菌株培養(yǎng)條件的優(yōu)化Fig. 2 Optimization of strain culture conditionsA. 不同pH對(duì)兩株菌生長(zhǎng)情況的影響; B. 不同溫度對(duì)兩株菌生長(zhǎng)情況的影響; C. 不同鹽度對(duì)兩株菌生長(zhǎng)情況的影響; D. 不同C/N對(duì)兩株菌生長(zhǎng)情況的影響A. Effects of different pH values on the growth of two strains of bacteria; B. Effects of different temperatures on the growth of two strains of bacteria; C. Effects of different salinities on the growth of two strains of bacteria; D. Effects of different C/N on the growth of two strains bacteria

表 3 篩選菌株的安全性檢測(cè)Tab. 3 Safety test of screening bacteria

2.2 復(fù)合菌對(duì)水質(zhì)調(diào)控效果的評(píng)價(jià)

復(fù)合菌與四種商品微生態(tài)制劑對(duì)養(yǎng)殖水體氨氮含量的影響添加復(fù)合菌的池塘在第1天和第5天, 氨氮含量顯著低于其他4種微生態(tài)制劑組和對(duì)照組, 說(shuō)明復(fù)合菌能快速有效地降解養(yǎng)殖水體中的氨氮; 隨著時(shí)間的延長(zhǎng), 在第9天, 復(fù)合菌組和強(qiáng)效EM菌組、芽孢桿菌組氨氮含量差異不顯著, 明顯低于2個(gè)對(duì)照組和光合細(xì)菌組、酵母菌組; 第11天和第18天, 復(fù)合菌組和光合細(xì)菌組氨氮含量差異不顯著, 明顯低于其他5組。總體來(lái)說(shuō), 從試驗(yàn)第1天開(kāi)始, 復(fù)合菌組的氨氮含量逐漸降低, 第11天以后,含量低于1 mg/L; 并且相較于其他各組, 復(fù)合菌組的氨氮含量一直處于最低水平。結(jié)果說(shuō)明, 添加復(fù)合菌的試驗(yàn)組降解氨氮效果快速并且持續(xù)性較好(圖 3)。

復(fù)合菌與四種商品微生態(tài)制劑對(duì)養(yǎng)殖水體亞硝酸鹽含量的影響試驗(yàn)5d后各組的亞硝酸鹽含量均有所升高; 復(fù)合菌組與酵母菌組亞硝酸鹽含量呈現(xiàn)一種先升后降的趨勢(shì), 并且在各個(gè)時(shí)間點(diǎn),與對(duì)照組差異不顯著; 添加強(qiáng)效EM菌和芽孢桿菌的兩組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)亞硝酸鹽含量相對(duì)較高, 9d和11d時(shí)含量均高達(dá)5 mg/L (圖 4)。

圖 3 五種微生態(tài)制劑對(duì)養(yǎng)殖水體氨氮的影響Fig. 3 Effects of five probiotics on ammonia nitrogen in aquaculture water同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫(xiě)字母差異顯著(P＜0.05); 下同Mean values in the same column with different superscripts were significant different (P＜0.05); the same applies below

圖 4 五種微生態(tài)制劑對(duì)養(yǎng)殖水體亞硝酸鹽的影響Fig. 4 Effects of five probiotics on nitrite in aquaculture water

復(fù)合菌與四種商品微生態(tài)制劑對(duì)養(yǎng)殖水體藻類數(shù)量的影響從第9天開(kāi)始, 添加復(fù)合菌與芽孢桿菌組藻類數(shù)量高于其他各組, 達(dá)到7萬(wàn)個(gè)/mL左右; 在第14天, 復(fù)合菌與芽孢桿菌組藻類數(shù)量顯著高于其他各組, 分別達(dá)到8萬(wàn)個(gè)/mL和9萬(wàn)個(gè)/mL左右, 大約為其他組的兩倍, 說(shuō)明二者能促進(jìn)藻類的增殖(圖 5)。從第5天開(kāi)始, 光合細(xì)菌組藻類數(shù)量明顯低于其他試驗(yàn)組及對(duì)照組, 差異顯著; 第14天, 光和細(xì)菌組藻類數(shù)量與復(fù)合菌、芽孢桿菌組差異極顯著。

3 討論

3.1 氨氮降解菌的篩選與培養(yǎng)條件的優(yōu)化

本試驗(yàn)用富集分離法篩選得到兩株高效降氨氮的菌株均為芽孢桿菌屬(Bacillus)的凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans), 對(duì)氨氮降解率分別達(dá)到97.8%和98.5%。這與前人研究結(jié)果一致, 郭靜等[19]從養(yǎng)殖水體中篩選出的凝結(jié)芽孢桿菌, 對(duì)氨氮和亞硝酸鹽氮的去除率分別達(dá)80.1%和91.2%, 具有較好的水質(zhì)凈化作用[19]。宋增福等[10]從對(duì)蝦養(yǎng)殖池塘中篩選出的凝結(jié)芽孢桿菌, 能夠在14h內(nèi)將亞硝酸鹽氮由10 mg/L降至0[10]。周文喆等[9]從河邊污泥中富集分離得到了一株降解氨氮的優(yōu)勢(shì)菌株, 鑒定為芽胞桿菌屬, 在24h內(nèi)可達(dá)到79.70%的降解率[9]。此外, 腸桿菌(Enterobactersp.)[11]、戈登氏菌(Gordonia)、紅球菌(Rhodococcus)[12]、溶桿菌(Lysobacter)、假單胞菌(Pseudomonas)[20,21]、產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes)[22]、反硝化細(xì)菌(Denitrificans)[23]等菌株被篩選出來(lái), 均可不同程度地降解氨氮。

氨氮是養(yǎng)殖水體富營(yíng)養(yǎng)化和水生動(dòng)物疾病的重要原因[24,25], 篩選水樣或泥樣中能高效降解氨氮的細(xì)菌, 并加以優(yōu)化培養(yǎng)再用于調(diào)控水質(zhì)是現(xiàn)在的主要研究方向。目前, 常用的篩選方法主要有3種:傳統(tǒng)培養(yǎng)法、指示劑法和改變培養(yǎng)條件法。胡君利等[26]比較了氨氮降解菌的篩選方法, 結(jié)果證明通過(guò)傳統(tǒng)培養(yǎng)法篩選往往無(wú)法得到目的菌株。也有研究通過(guò)在培養(yǎng)基中添加指示劑, 來(lái)推測(cè)目的菌株的存在[27]。改變培養(yǎng)條件法是現(xiàn)在常用的一種方法, 即根據(jù)所要篩選的菌株生長(zhǎng)特性, 設(shè)計(jì)、優(yōu)化一種或多種因素, 使目的菌株成為培養(yǎng)基中的優(yōu)勢(shì)菌株, 從而迅速篩選出來(lái)。對(duì)于氨氮降解菌來(lái)說(shuō),溫度、溶氧、pH、氨氮濃度等條件的優(yōu)化都有可能使氨氮降解菌成為混合培養(yǎng)物中的優(yōu)勢(shì)菌株, 從而更易被分離。本研究即是在培養(yǎng)基中添加NH4Cl作為唯一氮源進(jìn)行篩選得到了高效降解氨氮的菌株。

對(duì)篩選出的2株凝結(jié)芽孢桿菌培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果表明, 2菌株受pH變化影響不大, pH6.0—8.5時(shí),A600值始終保持在2左右; 最適溫度應(yīng)該在35—40℃左右; 在一定范圍內(nèi)(鹽度低于30‰), 鹽度對(duì)復(fù)合菌的生長(zhǎng)情況影響不大; C/N為15時(shí)兩株菌生長(zhǎng)狀況最好, C/N為20時(shí)xh1菌株依舊生長(zhǎng)良好。結(jié)果說(shuō)明, 篩選到的兩株凝結(jié)芽孢桿菌pH、C/N適應(yīng)范圍廣, 并且耐高溫、高鹽。王彥波等[28]也認(rèn)為篩選自南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖池塘的凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)溫度、pH和鹽度具有廣泛的適應(yīng)性[28]。這些優(yōu)點(diǎn)都有利于凝結(jié)芽孢桿菌在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用。

3.2 復(fù)合菌對(duì)水質(zhì)的調(diào)控

圖 5 五種微生態(tài)制劑對(duì)養(yǎng)殖水體藻類的影響Fig. 5 Effects of five kinds of probiotics on algae in aquaculture water

將篩選出的菌株潑灑于水體中對(duì)水質(zhì)進(jìn)行調(diào)控, 是益生菌的應(yīng)用之一, 也是本研究篩選菌株的目的之一。在潑灑到水體之前, 通過(guò)灌服試驗(yàn)檢測(cè)了所篩選出的2株凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)養(yǎng)殖動(dòng)物的安全性。灌服菌液濃度1×105—1×109的凝結(jié)芽孢桿菌,14d內(nèi)黃河鯉攝食能力和行動(dòng)狀態(tài)均正常, 均未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象, 與灌服生理鹽水的對(duì)照組無(wú)差異, 表明菌液是安全的。

以前的研究已證明, 單一菌種微生物在控制、凈化水質(zhì)方面都有一定的局限性[29—31], 因此在實(shí)際生產(chǎn)中, 往往使用2種或2種以上的有益菌共同發(fā)揮作用。本研究將前期篩選的枯草芽孢桿菌與本文篩選的凝結(jié)芽孢桿菌配制成復(fù)合菌, 用來(lái)調(diào)控養(yǎng)殖水體的水質(zhì)。將這2種芽孢桿菌聯(lián)合使用, 枯草芽孢桿菌首先將殘餌、糞便等分解為氨氮等小分子物質(zhì), 凝結(jié)芽孢桿菌再進(jìn)一步將氨氮等分解為硝酸鹽等無(wú)機(jī)物, 以此來(lái)調(diào)控養(yǎng)殖水體的水質(zhì)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示復(fù)合菌具有良好的降氨氮特性, 從試驗(yàn)第1天開(kāi)始, 復(fù)合菌組的氨氮含量逐漸降低, 第11天以后, 含量低于1 mg/L; 并且相較于其他各組, 復(fù)合菌組的氨氮含量一直處于最低水平, 說(shuō)明復(fù)合菌降解氨氮效果快速并且持續(xù)性較好。在氨氮含量下降的同時(shí), 亞硝酸鹽含量有上升的趨勢(shì), 試驗(yàn)5d后各組的亞硝酸鹽含量均有所升高, 可能是氨氮氧化成亞硝酸鹽所造成的。并且復(fù)合菌組與酵母菌組亞硝酸鹽含量呈現(xiàn)一種先升后降的趨勢(shì), 在試驗(yàn)的第18天含量明顯降低, 說(shuō)明添加的復(fù)合菌有一定的降亞硝酸鹽效果, 但比較緩慢。在后續(xù)復(fù)合菌研制試驗(yàn)中, 應(yīng)添加硝化或反硝化細(xì)菌, 以盡快降低亞硝酸鹽含量。

3.3 復(fù)合菌對(duì)藻類數(shù)量的影響

本文發(fā)現(xiàn), 從第9天開(kāi)始添加復(fù)合菌與芽孢桿菌組藻類數(shù)量高于其他各組, 達(dá)到7萬(wàn)個(gè)/mL左右;在第14天, 復(fù)合菌與芽孢桿菌組藻類數(shù)量顯著高于其他各組, 分別達(dá)到8和9萬(wàn)個(gè)/mL左右, 大約為其他組的2倍, 說(shuō)明添加復(fù)合菌與芽孢桿菌對(duì)藻類數(shù)量的增加效果顯著(圖 5)。其原因是由于藻類與細(xì)菌之間的互利共生關(guān)系, 藻類是生活在水體中的的光合自養(yǎng)型生物, 通過(guò)光合作用將二氧化碳轉(zhuǎn)換為有機(jī)物, 為異養(yǎng)生物(如細(xì)菌)提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì), 并產(chǎn)生氧氣提供給需氧細(xì)菌, 然后細(xì)菌分解有機(jī)物使之轉(zhuǎn)化成藻類生長(zhǎng)的養(yǎng)分無(wú)機(jī)鹽類, 如: 硝酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽等, 并釋放二氧化碳, 以供藻類光合作用[32,33]。富麗靜等[34]將以芽孢桿菌為主體的復(fù)合微生態(tài)制劑潑灑到養(yǎng)殖水體中, 發(fā)現(xiàn)可促進(jìn)單細(xì)胞藻類硅藻、裸藻生長(zhǎng)使其成為優(yōu)勢(shì)菌群。林東年等[35]認(rèn)為在羅非魚(yú)池中投放芽孢桿菌復(fù)合制劑可使綠藻保持優(yōu)勢(shì)地位。石洪玥等[36]證明向池塘中潑灑高效微生態(tài)制劑, 對(duì)養(yǎng)魚(yú)池塘中優(yōu)勢(shì)藻類藍(lán)藻的繁殖有明顯的抑制作用, 對(duì)綠藻和硅藻的繁殖有明顯的促進(jìn)作用。張慶等[37]研究發(fā)現(xiàn)在養(yǎng)殖環(huán)境中添加芽孢桿菌制劑可增加硅藻數(shù)量。以上研究表明芽孢桿菌可促進(jìn)硅藻等單細(xì)胞藻類的生長(zhǎng), 單細(xì)胞藻類通過(guò)光合作用可為養(yǎng)殖水環(huán)境提供氧氣,供水生動(dòng)植物等使用, 如此反復(fù)形成一個(gè)良性循環(huán)。

光合細(xì)菌具有抑藻作用已是大家的共識(shí), 本研究也發(fā)現(xiàn)從第5天開(kāi)始, 潑灑光合細(xì)菌組藻類數(shù)量明顯低于其他試驗(yàn)組及對(duì)照組, 差異顯著; 第14天,光和細(xì)菌組藻類數(shù)量與復(fù)合菌、芽孢桿菌組差異極顯著。這與陳小晨等[38]研究結(jié)果一致。