張望寧，張 慧，周 穎，胡 剛

(安徽大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，安徽 合肥 230601)

槲皮素(圖示1)，又名櫟精，槲皮黃素，存在于許多植物的花、葉、果實(shí)中，可作為藥品，具有祛痰、止咳、平喘、降血壓、降血脂等功效,它還能擴(kuò)張冠狀動脈，增加冠脈血流量，還有一定的抗腫瘤作用[1-6].由于槲皮素有很好的藥學(xué)性能，因此，對槲皮素的檢測很有意義.常用的檢測槲皮素的方法主要有高效液相色譜[7-9]、反相高效液相色譜[10-11]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀[10]、紫外分光光度法[12]、薄層色譜法[13]、熒光光譜法[14]、拉曼光譜法等[15-17].而筆者采用了一種新方法來測定槲皮素即利用新型的Briggs-Rauscher(BR)化學(xué)振蕩體系.

圖示1 槲皮素的結(jié)構(gòu)

筆者建立了一種新型的BR化學(xué)振蕩體系(H2SO4-KIO3-MA- [NiL](ClO4)2-H2O2)來實(shí)現(xiàn)對槲皮素的定量分析.通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在BR化學(xué)振蕩體系中加入一定量的槲皮素，會使該體系受到抑制，振蕩暫停，產(chǎn)生一段抑制時(shí)間后恢復(fù)振蕩.抑制時(shí)間隨加入槲皮素濃度的變化而變化.根據(jù)加入不同濃度的槲皮素溶液與抑制時(shí)間(tin)之間的良好線性關(guān)系，建立相應(yīng)的工作曲線來實(shí)現(xiàn)對槲皮素的定量分析測定.此種定量分析測定槲皮素的方法不僅精確度高、可重復(fù)性好、直觀性強(qiáng)，此外其測定范圍廣、檢測下線低、儀器操作簡單.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

儀器：213型鉑電極,上海雷磁儀器有限公司；217 型甘汞電極,上海雷磁儀器有限公司；79-3 型磁力加熱攪拌器,金壇市寶塔儀電廠；FA1004N 型電子分析天平,上海精學(xué)科學(xué)儀器有限公司；LK2005型電化學(xué)工作站,天津蘭力科化儀器；Instrument Amplifier(信號放大器)、GO!LINK(數(shù)據(jù)采集器),美國威尼爾軟件與技術(shù)公司；20～200 μL移液槍,Thermo Scientific.

試劑：槲皮素,分析純，阿拉丁試劑有限公司；98% 濃硫酸(H2SO4)、碘酸鉀(KIO3)、30% 過氧化氫(H2O2)，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；丙二酸(MA)(分析純，阿拉丁試劑有限公司)；催化劑四氮雜大環(huán)二烯鎳([NiL](ClO4)2)(圖示2 )按照參考文獻(xiàn)上的方法[33-34]合成.

圖示2 [NiL](ClO4)2的結(jié)構(gòu)

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

首先，用98%的濃H2SO4配制濃度為2.5×10-2mol·L-1H2SO4，然后用2.5×10-2mol·L-1H2SO4作為溶劑配制0.14 mol·L-1KIO3、2.00 mol·L-1丙二酸(MA)、0.017 3 mol·L-1[NiL]-(ClO4)2、4.00 mol·L-1H2O2溶液.

接下來將鉑電極和甘汞電極與放大器(instrument amplifier)連接，再將放大器(instrument amplifier)與GO!LINK數(shù)據(jù)采集器連接，再與裝有l(wèi)ogger lite軟件的電腦連接.

然后在 50 mL 燒杯中依次加入14.5 mL 2.5×10-2mol·L-1H2SO4、7 mL 0.14 mol·L-1KIO3、3.5 mL 2 mol·L-1丙二酸(MA)、2 mL 0.017 3 mol·L-1[NiL](ClO4)2溶液后，將此燒杯放置在磁力攪拌器上.打開磁力攪拌器，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為550 r·min-1.控制實(shí)驗(yàn)溫度為(4 ± 0.5) ℃.再將鉑電極和甘汞電極插入混合溶液中，打開Logger Lite軟件，打開“Experiment”欄中的“Date Collection”窗口，將采樣時(shí)間設(shè)置為6 000 s、采樣速度設(shè)置為每次0.5 s，再加入13 mL 4.00 mol·L-1H2O2溶液.然后點(diǎn)擊“Collect”，軟件將會自動記錄體系電勢隨時(shí)間變化的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù).在過氧化氫溶液加入體系混合后，經(jīng)過一段時(shí)間的誘導(dǎo)期后，體系開始振蕩，混合液顏色也發(fā)生著從黃色到棕色的周期性變化，其振蕩圖譜如圖 1(a) 所示.按照上述的實(shí)驗(yàn)步驟，在振蕩體系進(jìn)入第 5 個(gè)振蕩電位最低點(diǎn)時(shí)，用移液器向體系中加入 5.0×10-6mol·L-1的槲皮素，可以看到槲皮素的加入，使得體系振蕩停止，經(jīng)過一段時(shí)間后，振蕩又重新恢復(fù)，振蕩圖譜如圖 1(b)所示.為了方便探究不同濃度槲皮素對體系產(chǎn)生的擾動，定義從加入被測物質(zhì)到體系振蕩重新恢復(fù)之間的這段時(shí)間為抑制時(shí)間(tin).

共同條件：c(H2SO4)=2.5×10-2 mol·L-1;c(KIO3)=2.45×10-2 mol·L-1;c(MA)=0.175 mol·L-1;c([NiL]-(ClO4)2)=8.65×10-4 mol·L-1;c(H2O2)=1.3 mol·L-1.T=(4±0.5) ℃;R=550 r·min-1.(a):典型振蕩圖形；(b):5.0×10-6 mol·L-1槲皮素對體系擾動后的振蕩圖形.圖1 加入槲皮素前后BR化學(xué)振蕩體系的振蕩圖形

2 結(jié)果與討論

2.1 振蕩體系反應(yīng)條件的優(yōu)化

BR化學(xué)振蕩體系包含多種物質(zhì)組分，其反應(yīng)敏感度很高，實(shí)驗(yàn)中各種參數(shù)的變化，會使被測物質(zhì)對體系的擾動響應(yīng)產(chǎn)生變化.因此，為了探究槲皮素定量分析測定的最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件，通過采用控制變量法，對該體系中各種物質(zhì)組分(H2SO4、KIO3、MA、[NiL](ClO4)2、H2O2)進(jìn)行逐一探討，研究各種物質(zhì)濃度對振蕩體系產(chǎn)生的影響.探究結(jié)果如圖2所示.

(a)：c([H2SO4])=0.020 625 ～ 0.040 625 mol·L-1，c(KIO3)=2.45 × 10-2 mol·L-1，c(MA)=0.175 mol·L-1，c([NiL]-(ClO4)2)= 8.65 × 10-4 mol·L-1，c(H2O2)= 1.3 mol·L-1；(b)：c(KIO3) =0.014 ～ 0.031 5 mol·L-1，c(H2SO4)=2.5 × 10-2 mol·L-1，c(MA)=0.175 mol·L-1，c([NiL](ClO4)2)= 8.65 × 10-4 mol·L-1，c(H2O2)= 1.3 mol·L-1；(c)：c(MA)=0.125 ～ 0.2 mol·L-1，c(H2SO4)=2.5 × 10-2 mol·L-1，c(KIO3)=2.45 × 10-2 mol·L-1，c([NiL](ClO4)2)= 8.65 × 10-4 mol·L-1，c(H2O2)= 1.3 mol·L-1；(d)：c([NiL](ClO4)2)= 6.055×10-4 ～ 1.51 × 10-3 mol·L-1，c(H2SO4)=2.5 × 10-2 mol·L-1，c(KIO3)=2.45 × 10-2 mol·L-1，c(MA)=0.175 mol·L-1，c(H2O2)= 1.3 mol·L-1；(e)：c(H2O2)=0.1 ～ 1.8 mol·L-1，c(H2SO4)=2.5 × 10-2 mol·L-1，c(KIO3)=2.45 × 10-2 mol·L-1，c(MA)=0.175 mol·L-1，c([NiL](ClO4)2)= 8.65 × 10-4 mol·L-1；共同條件：T=(4 ± 0.5) ℃; R=550 r·min-1.圖2 H2SO4 (a)、KIO3 (b)、MA (c)、NiL(ClO4)2 (d)、H2O2 (e) 的濃度變化對振蕩體系產(chǎn)生的影響

如圖2(a)所示，保持溫度轉(zhuǎn)速不變，保持c(KIO3)、c(MA)、c([NiL](ClO4)2)、c(H2O2)不變，改變H2SO4的濃度，研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素對體系產(chǎn)生的抑制時(shí)間隨著振蕩體系中H2SO4濃度的逐漸增加而逐漸減小.當(dāng)體系中的H2SO4濃度大于2.5×10-2mol·L-1時(shí)，振蕩體系不太穩(wěn)定，而且振蕩圖形不飽滿；當(dāng)體系中的H2SO4濃度小于2.5×10-2mol·L-1時(shí)，振蕩體系的誘導(dǎo)時(shí)間較長；當(dāng)體系中的H2SO4濃度為2.5×10-2mol·L-1時(shí)，振蕩體系抑制時(shí)間較短，振蕩振幅穩(wěn)定且振蕩圖形飽滿.因此，選擇H2SO4濃度為2.5×10-2mol·L-1作為分析測定槲皮素的較佳濃度.

如圖2(b)所示，保持其他4種組分濃度和溫度轉(zhuǎn)速條件不變，當(dāng)體系中KIO3濃度大于2.45×10-2mol·L-1，槲皮素對體系產(chǎn)生的抑制時(shí)間較短，振蕩壽命較短.當(dāng)體系中KIO3濃度小于2.45×10-2mol·L-1，振蕩壽命短，且振蕩不穩(wěn)定.當(dāng)體系中的KIO3濃度為2.45×10-2mol·L-1時(shí)，振蕩體系穩(wěn)定，而且振蕩圖形飽滿.因此，選擇KIO3濃度為2.45×10-2mol·L-1作為分析測定槲皮素的較佳濃度.

丙二酸(MA)結(jié)構(gòu)中含有活潑的亞甲基，是BR振蕩體系中最為常用的有機(jī)底物.如圖2(c)所示，保持其他4種組分濃度和溫度轉(zhuǎn)速條件不變，從0.1～0.25 mol·L-1改變丙二酸的濃度，當(dāng)其濃度為0.175 mol·L-1時(shí)，振蕩體系最為穩(wěn)定且振蕩圖形飽滿.因此，選擇此濃度作為分析測定槲皮素的較佳濃度.

大環(huán)鎳含有大π電子結(jié)構(gòu)，能夠使電子的傳遞過程加快，大環(huán)鎳([NiL](ClO4)2)催化的BR體系的振蕩圖譜更為穩(wěn)定、振蕩壽命更長，這歸功于大環(huán)鎳配合物上的類卟啉結(jié)構(gòu).同理，保持其他4種組分濃度和溫度轉(zhuǎn)速條件不變，逐漸改變大環(huán)鎳([NiL](ClO4)2)的濃度，如圖2(d)所示，隨著大環(huán)鎳濃度的增加，抑制時(shí)間逐漸減小.當(dāng)大環(huán)鎳([NiL](ClO4)2)的濃度為8.65×10-4mol·L-1，振蕩體系圖形最優(yōu).因此，選擇此濃度條件為分析測定槲皮素較佳條件.

如圖2(e)所示，保持其他4種組分濃度和溫度轉(zhuǎn)速條件不變，從0.8～1.6 mol·L-1逐漸改變過氧化氫(H2O2)的濃度.當(dāng)過氧化氫濃度為1.3 mol·L-1時(shí)，振蕩體系最為穩(wěn)定.因此，選擇此濃度條件為分析測定槲皮素較佳濃度.

2.2 利用BR振蕩體系定量分析測定槲皮素

在上述探究的分析檢測槲皮素的較佳條件下，根據(jù)加入不同濃度的槲皮素溶液與抑制時(shí)間(tin)之間的關(guān)系，建立一個(gè)槲皮素濃度與抑制時(shí)間(tin)的工作曲線來實(shí)現(xiàn)對槲皮素的定量分析,結(jié)果如圖3所示.

共同條件：c(H2SO4)=2.5×10-2 mol·L-1;c(KIO3)=2.45×10-2 mol·L-1;c(丙二酸)=0.175 mol·L-1;c([NiL](ClO4)2)=8.65×10-4 mol·L-1;c(H2O2)=1.3 mol·L-1. T=(4±0.5) ℃; R=550 r·min-1.圖3 抑制時(shí)間(tin)與槲皮素濃度(c(槲皮素))的關(guān)系

如圖3 (a)所示，在槲皮素濃度為低濃度1.0×10-6～4.5×10-6mol·L-1范圍內(nèi)，體系產(chǎn)生的抑制時(shí)間與加入的槲皮素濃度之間呈一次線性關(guān)系，線性回歸方程為tin=5.394 524+2.423 81×107c(槲皮素)，R=0.997，N=8；如圖3(b)所示，在槲皮素濃度為高濃度4.5×10-6～3.5×10-5mol·L-1范圍內(nèi)，體系產(chǎn)生的抑制時(shí)間與加入的槲皮素濃度之間也呈一次線性關(guān)系，線性回歸方程為tin=-423.965 94+8.170 44×107c(槲皮素)，R=0.994，N=7.

利用 BR化學(xué)振蕩體系定量分析測定槲皮素的這種方法可重復(fù)性很好.在較佳條件下，加入 3. 5×10-6mol·L-1槲皮素到BR化學(xué)振蕩體系中，記錄其產(chǎn)生的抑制時(shí)間，重復(fù)做10組，最后計(jì)算RSD 為 4.19% ，其回收率結(jié)果如表1所列.結(jié)果表明該方法測定槲皮素準(zhǔn)確、重復(fù)性好.

表1 槲皮素在BR振蕩體系中的回收率

2.3 干擾離子的影響

除了試劑濃度和溫度變化的影響外，[NiL](ClO4)2催化BR化學(xué)振蕩體系受外來離子干擾的影響很大.筆者研究了各種離子對槲皮素定量分析的影響(如表2所示)，發(fā)現(xiàn)只有I-和Br-會對BR化學(xué)振蕩體系產(chǎn)生影響，從而影響槲皮素的定量分析，其他離子如Na+不會對BR化學(xué)振蕩體系產(chǎn)生影響，不影響槲皮素的定量分析.因此，對于I-、Br-等摩爾比較小的離子，為了規(guī)避它們對槲皮素定量分析的影響，在實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)盡可能地避免引入.

表2 干擾離子對槲皮素定量分析的影響

2.4 振蕩體系反應(yīng)機(jī)制的探究

對于[NiL]2+催化振蕩反應(yīng)，筆者提出了一個(gè)包含12步反應(yīng)的反應(yīng)機(jī)制：其中的11步反應(yīng)是在NF模型[35]的基礎(chǔ)之上提出的，另外一步反應(yīng)(反應(yīng)(10))來自FCA模型[36]. 反應(yīng)機(jī)制如下

HOI+I-+H+?I2+H2O

(1)

HIO2+I-+H+→2HOI

(2)

(3)

(4)

(5)

2HOO·→H2O2+O2

(6)

HOI+H2O2→I-+O2+H++H2O

(7)

IO2·+[NIL]2++H+?[NIL]3++HIO2

(8)

H2O2+[NIL]3+→[NIL]2++HOO·+H+

(9)

(10)

MA?MA(enol)

(11)

I2+MA(enol)→MAI(IMAI)+H2O

(12)

根據(jù)以上的12步反應(yīng)機(jī)制可知，不僅體系的初始組分物質(zhì)可能會與槲皮素發(fā)生反應(yīng)，體系中不斷產(chǎn)生的中間物質(zhì)也可能與槲皮素發(fā)生反應(yīng).

為了探究體系中具體哪些物質(zhì)與槲皮素發(fā)生了反應(yīng)，筆者測試了以下4組循環(huán)伏安實(shí)驗(yàn)：(1) H2SO4+KIO3;(2) H2SO4+[NiL](ClO4)2;(3) H2SO4+MA;(4) H2SO4+H2O2.分別加入不同濃度的槲皮素溶液到這4組實(shí)驗(yàn)中，掃描出加入槲皮素前后的循環(huán)伏安圖，觀察循環(huán)伏安圖上是否有氧化還原峰出現(xiàn)，氧化還原峰的位置是否發(fā)生變化.結(jié)果如圖4所示.

反應(yīng)條件：c(H2SO4)=2.5×10-2 mol·L-1;c(KIO3) =2.45×10-2 mol·L-1;Scan rate=100 mV·s-1.圖4 循環(huán)伏安圖：H2SO4+KIO3+槲皮素溶液

由圖4可知，僅在酸性KIO3溶液中改變槲皮素的濃度時(shí)，氧化還原峰的位置才發(fā)生顯著變化，說明槲皮素僅與KIO3發(fā)生氧化還原反應(yīng).

盡管循環(huán)伏安實(shí)驗(yàn)顯示了槲皮素可以直接和KIO3反應(yīng)，但是，如果槲皮素與KIO3直接反應(yīng)，那么槲皮素的數(shù)量將會迅速消耗，不會產(chǎn)生抑制時(shí)間.事實(shí)上在實(shí)驗(yàn)中觀測到了抑制時(shí)間，由此可以推斷槲皮素不是直接與KIO3反應(yīng)，可能是與振蕩反應(yīng)中產(chǎn)生的中間物質(zhì)過氧化氫自由基HOO·反應(yīng)，結(jié)果產(chǎn)生抑制時(shí)間tin.反應(yīng)式如下

(13)

(14)

槲皮素與過氧化氫自由基(HOO·)發(fā)生反應(yīng)，會消耗HOO·，使得反應(yīng)(10)中IO2·濃度降低，接著會導(dǎo)致反應(yīng)(8)的正反應(yīng)速率減慢，影響反應(yīng)(9)的發(fā)生，致使[NiL]2+難以生成，反過來又影響反應(yīng)(8)的發(fā)生.從而使[NiL]3+與[NiL]2+之間無法相互轉(zhuǎn)換，反應(yīng)鏈被中斷，導(dǎo)致振蕩暫時(shí)停止，從而產(chǎn)生了相應(yīng)的抑制時(shí)間.因?yàn)榧尤塍w系中的槲皮素是非常微量的，當(dāng)體系中的槲皮素全部被消耗時(shí)，HOO·又可以重新參與反應(yīng)，體系振蕩便重新恢復(fù).

3 結(jié)束語

筆者研究了利用四氮雜大環(huán)二烯鎳催化的Briggs-Rauscher 化學(xué)振蕩反應(yīng)實(shí)現(xiàn)對酚類抗氧化劑物質(zhì)槲皮素的定量分析方法.探討了BR 化學(xué)振蕩體系中各物質(zhì)組分(H2SO4、KIO3、MA、[NiL]-(ClO4)2、H2O2)初始濃度對振蕩體系的影響，確定了定量分析測定槲皮素的較佳條件.根據(jù)抑制時(shí)間(tin)與槲皮素濃度之間的線性關(guān)系，建立了一個(gè)槲皮素濃度與抑制時(shí)間(tin)的工作曲線，實(shí)現(xiàn)了對槲皮素的定量分析測定，槲皮素在該BR化學(xué)振蕩體系中的檢測范圍是1.0×10-6～3.5×10-5mol·L-1.在低濃度1.0×10-6～4.5×10-6mol·L-1范圍內(nèi)呈一次線性關(guān)系，tin=5.394 524+2.423 81×107×c(槲皮素)，R=0.997，N=8；在高濃度4.5×10-6～3.5×10-5mol·L-1范圍內(nèi)也呈一次線性關(guān)系，tin=-423.965 94+8.170 44×107c(槲皮素) ，R=0.994，N=7.此外，通過循環(huán)伏安實(shí)驗(yàn)證明了槲皮素可以與碘酸鉀發(fā)生氧化還原反應(yīng)，并在FCA模型上提出了較為可靠的反應(yīng)機(jī)制.因此，筆者實(shí)驗(yàn)所采用的BR化學(xué)振蕩體系非常適合用來定量分析槲皮素等酚類有機(jī)物.