韓 雪，崔勇青，胡子穎，魏仙萍，黃亞輝，孔令保,鄭 義

(1.江漢大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430056； 2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，江西 南昌 330045；3.花都市人民醫(yī)院 檢驗科，廣東 花都 510800)

梅毒密螺旋體蒼白亞種(Treponemapallidumsubsp. pallidum，簡稱TP)是梅毒(Syphilis)的病原體，主要通過性行為進(jìn)行傳播，會導(dǎo)致心血管及中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害等嚴(yán)重后果[1-2].目前，以青霉素為主的抗生素療法是治療梅毒的主要手段[3]，但由于梅毒診斷方法不夠完善，導(dǎo)致很多患者錯過了最佳治療時期[4].此外，梅毒病原體目前不能進(jìn)行體外培養(yǎng)，相關(guān)蛋白功能難以鑒定，使疫苗的研究進(jìn)展非常緩慢，僅滅活疫苗研究有初步報道[5].在我國，梅毒發(fā)病人數(shù)呈快速增加趨勢，病例數(shù)從2009年32萬增加到2017年46萬.

梅毒螺旋體的基因組全長為1 138 006 bp，其主要抗原集中在外膜蛋白和脂蛋白中.Tp0453蛋白位于梅毒螺旋體的外膜，全長287 aa，分子量為32 kD.Tp0453蛋白免疫原性強(qiáng)，分子結(jié)構(gòu)以螺旋為主結(jié)，無片層結(jié)構(gòu)，研究表明，其與梅毒血清抗體反應(yīng)靈敏度和特異性高，且與其他螺旋體及細(xì)菌無交叉反應(yīng)，可用于梅毒抗體檢測[6-8]，同時其含有多個抗原決定簇，可刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體[9].Gpd為梅毒螺旋體脂蛋白，位于外膜上，含有357 aa,蛋白分子量約為40 kD.對不同梅毒螺旋體株的Gpd氨基酸序列進(jìn)行比對分析，發(fā)現(xiàn)其序列高度保守,但與其他細(xì)菌同源性低[10].利用重組Gpd蛋白作為抗原，可以對梅毒患者血清實現(xiàn)特異性檢出[8]；重組Gpd蛋白及Gpd核酸疫苗免疫家兔，可使家兔產(chǎn)生特異性抗體[11-12].因此, Gpd蛋白可作為梅毒診斷試劑及疫苗研制的一個候選蛋白.

筆者利用大腸桿菌表達(dá)梅毒重組蛋白Tp0453-Gpd，該蛋白含有Tp0453蛋白(56—287 aa)片段及Gpd全蛋白.以重組蛋白作為抗原，對人血清樣本進(jìn)行梅毒特異性抗體檢測，梅毒患者樣本組與非梅毒患者樣本組的結(jié)果存在非常顯著性差異，表明融合蛋白可被梅毒抗體特異性識別，具有免疫反應(yīng)性.利用重組蛋白免疫新西蘭兔，兔血清中可檢測到高水平梅毒抗體，說明重組蛋白具有良好免疫原性.因此，筆者實驗中所表達(dá)的梅毒重組蛋白Tp0453-Gpd可以作為梅毒診斷試劑及蛋白疫苗的理想候選抗原.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人工合成梅毒重組Tp0453-Gpd蛋白基因，由上海宇玫博生物科技有限公司完成，并連接到載體PET-HIS-28a上，構(gòu)建PET-HIS-28a-Tp0453-Gpd重組質(zhì)粒.大腸桿菌Escherichiacoli(E.coli)BL21(DE3)為筆者實驗室保存.12份梅毒陽性血清(TPPA及臨床確診陽性)及12份梅毒陰性血清(TPPA及臨床確診陰性)，由花都市人民醫(yī)院鄭義博士提供.

1.2 方 法

蛋白表達(dá)：重組質(zhì)粒Tp0453-Gpd轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E．coliBL21(DE3)中，37 ℃過夜培養(yǎng)后，10%轉(zhuǎn)種SOB，37 ℃培養(yǎng)2.5 h，然后在異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside，簡稱IPTG)濃度為1.5 mmol·L-1,28 ℃條件下誘導(dǎo)表達(dá)8 h，轉(zhuǎn)速為220 r·min-1.

蛋白純化：菌體超聲波處理后，離心取包涵體沉淀，包涵體尿素重溶，加入咪唑進(jìn)行鎳柱親合層析，并利用尿素濃度為6 N的IMAC-5，20，40，80，100，200梯度洗脫液進(jìn)行洗脫.各洗脫組分PBS緩沖液4 ℃透析24 h.

Western blot鑒定：蛋白SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移到PVDF上，BSA封閉后，以梅毒抗體陽性血清為一抗(陰性對照中一抗為梅毒抗體陰性血清)，羊抗人IgG為二抗，DAB顯色.

人血清抗體檢測：重組蛋白Tp0453-Gpd包板，脫脂牛奶封閉后，一抗為待測人血清，二抗為羊抗人IgG，TMB顯色，檢測吸光度.

數(shù)據(jù)處理：酶聯(lián)免疫血清反應(yīng)檢測結(jié)果利用生物統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS進(jìn)行顯著性分析.

注射樣品制備：純化好的重組蛋白50 μg,均勻重懸于200 μL PBS緩沖液,等體積佐劑乳化，第1針佐劑為CFA，第2，3針佐劑為IFA.

免疫家兔及血清采樣：雄性新西蘭兔分別在第1，7，14天注射重組融合蛋白疫苗1次.耳緣處每周取血樣1次.

兔抗血清效價檢測(ELISA)：重組蛋白Tp0453-Gpd包被酶標(biāo)板，BSA封閉，一抗為100 μL兔血清，37 ℃孵育2 h；二抗為100 μL羊抗兔IgG，37 ℃靜置1 h；TMB顯色，硫酸終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀450 nm條件下測量吸光值(OD450).

2 結(jié)果與分析

2.1 重組蛋白Tp0453-Gpd表達(dá)與純化

基因工程菌被誘導(dǎo)表達(dá)后，對所表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行純化，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖1所示.

M:蛋白質(zhì)Marker;1:誘導(dǎo)前菌體上清液；2：誘導(dǎo)后菌體上清液；3.誘導(dǎo)后菌體沉淀物；4：純化的蛋白.圖1 重組蛋白Tp0453-Gpd表達(dá)與純化

從圖1可知，基因工程菌誘導(dǎo)表達(dá)8 h后，在重組蛋白預(yù)期分子量64 kD處出現(xiàn)了明顯蛋白表達(dá)帶，而誘導(dǎo)前菌體樣本無此條帶出現(xiàn)，說明重組Tp0453-Gpd蛋白被成功表達(dá).超聲波處理后，發(fā)現(xiàn)重組蛋白在大腸桿菌中以包涵體形式存在.重組蛋白包涵體經(jīng)過鎳柱親合層析后，得到純化的梅毒重組蛋白Tp0453-Gpd.

2.2 重組蛋白Tp0453-Gpd的免疫反應(yīng)性分析

梅毒抗體陽性血清樣本來自TPPA確診梅毒患者，梅毒抗體陰性血清樣本來自TPPA確診非梅毒患者.重組蛋白Western blot結(jié)果如圖2所示.

以重組蛋白為抗原包被酶標(biāo)板，酶聯(lián)免疫法檢測待測人血清中梅毒特異性抗體，結(jié)果如圖3所示.

(a)為重組蛋白孵育梅毒抗體陽性血清結(jié)果；(b)為重組蛋白孵育梅毒抗體陰性結(jié)果.圖2 Tp0453-Gpd抗原特異性檢測

圖3 Tp0453-Gpd與人血清反應(yīng)性的統(tǒng)計學(xué)分析

圖2顯示，一抗孵育梅毒患者血清的樣品出現(xiàn)特異性帶，而一抗為梅毒陰性血清孵育的樣品沒有任何帶，說明Tp0453-Gpd蛋白可以被梅毒患者血清中的梅毒抗體特異性識別.

由圖3可以看出，梅毒患者血清樣本平均OD450值為P=1.02，非梅毒患者血清平均OD450值為N=0.22，P/N=4.6.數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析后，得到p<0.01，表明梅毒血清樣本組與非梅毒血清組樣本組的檢測結(jié)果存在極其顯著性差異，重組蛋白血清學(xué)檢測結(jié)果與TPPA檢測結(jié)果符合度為100%.

2.3 重組蛋白Tp0453-Gpd免疫原性分析

對免疫后的新西蘭兔進(jìn)行不同時間段取血，酶聯(lián)免疫法檢測兔血清中抗體滴度水平，結(jié)果如圖4所示.

圖4 Tp0453-Gpd抗體滴度與免疫時間關(guān)系示意圖

由圖4可知，免疫家兔血清中，第4周開始可以檢測出特異性抗體，此后抗體滴度迅速增加，并在第14周達(dá)到最高峰為1∶2 000，第15周抗體滴度開始緩慢下降，至檢測周期(20周)內(nèi)抗體滴度依舊保持在一個較高水平.

3 討 論

目前主要采用TPPA法對梅毒進(jìn)行確診,該方法是利用梅毒螺旋體作為抗原，通過檢測血清中梅毒抗體來確診梅毒螺旋體感染，但由于現(xiàn)階段梅毒螺旋體只能在雄性兔子睪丸中進(jìn)行擴(kuò)增，增殖效率低，并且操作繁瑣，提純困難，因此造成TPPA檢測試劑成本高，售價昂貴；另外，TPPA法結(jié)果的判斷主觀性強(qiáng)，需要實驗人員有豐富的經(jīng)驗，所以不適合基層醫(yī)院大規(guī)模推廣，利用梅毒特異性抗原進(jìn)行血清學(xué)檢測是目前梅毒檢測的研究熱點.TP外膜蛋白Tp0453及脂蛋白Gpd均有一定免疫原性，研究報道這兩個蛋白可識別梅毒患者血清中的梅毒抗體，是梅毒新型診斷試劑候選蛋白[8，12-13].Tp0453雖然對各期梅毒可以檢出，但對潛伏期梅毒檢測結(jié)果穩(wěn)定性不太理想，而Gpd對潛伏期檢測結(jié)果比較穩(wěn)定[8].筆者通過基因工程手段，利用大腸桿菌表達(dá)梅毒重組融合蛋白Tp0453-Gpd，重組蛋白融合了Tp0453(56—287 aa)片段及Gpd全片段，包涵了蛋白Tp0453及Gpd重要抗原表位.Tp0453蛋白1—55位氨基酸免疫原性不強(qiáng)，且疏水性氨基酸過于密集，不利于表達(dá)，所以被去除.以重組蛋白Tp0453-Gpd作為抗原，通過ELISA檢測人血清樣本，發(fā)現(xiàn)梅毒患者樣本組吸光平均值為1.02，非梅毒患者樣本組吸光平均值為0.22，p<0.01,說明梅毒患者血清組和非梅毒患者血清組檢測結(jié)果存在極顯著差別，檢測結(jié)果與TPPA檢測結(jié)果符合度為100%.研究報道，利用重組Tp0453檢測病人血清中的梅毒抗體與TPPA符合度為100%[8-9,13]，TpGpd重組蛋白檢測結(jié)果與TPPA符合率達(dá)93%[8,12]，與文中研究結(jié)果類似.因此，該文中所表達(dá)的重組蛋白Tp0453-Gpd具有良好的免疫反應(yīng)性，可作為梅毒診斷試劑的候選蛋白.

現(xiàn)階段，梅毒螺旋體活體培養(yǎng)效率低，梅毒蛋白功能所知尚少，也沒有合適的動物模型，這些問題導(dǎo)致梅毒疫苗研發(fā)進(jìn)展緩慢[14].在梅毒螺旋體感染早期，巨噬細(xì)胞的吞噬和抗體的中和作用是機(jī)體清除病原體的主要方式[15]，因此，如何讓機(jī)體有效產(chǎn)生抗體是梅毒疫苗設(shè)計的重點，Tp0453、Gpd是梅毒外膜蛋白中免疫原性強(qiáng)的蛋白，擁有多個重要抗原決定簇，具有成為梅毒蛋白疫苗主要成分的潛質(zhì)[15-17].筆者研究所表達(dá)的重組蛋白含有Tp0453、Gpd蛋白的抗原決定簇，使重組融合蛋白具備刺激機(jī)體產(chǎn)生梅毒特異性抗體的潛力.重組蛋白免疫家兔實驗表明，家兔血清中第4周起內(nèi)可以檢測到抗體，并長時間維持在一個較高滴度水平，說明融合蛋白的抗原決定簇得到較好的暴露和提成，有效刺激了機(jī)體產(chǎn)生梅毒特異性抗體，也說明蛋白具有良好的免疫原性.該重組蛋白Tp0453-Gpd免疫兔子，血清抗體滴度達(dá)到1∶2 000以上.之前所報道的重組蛋白TP0453免疫家兔后，抗體滴度達(dá)到1∶1 280[9]；重組Gpd蛋白免疫家兔后抗體滴度達(dá)到1∶1 280[12]；Gpd核酸疫苗免疫家兔后抗體最高達(dá)到1∶1 024[17].

筆者在大腸桿菌中首次成功表達(dá)了梅毒重組融合蛋白Tp0453-Gpd，該重組蛋白可被梅毒患者血清抗體特異性識別，有良好的免疫反應(yīng)性.蛋白免疫家兔后，可刺激家兔產(chǎn)生高水平特異性抗體，有一定免疫原性.因此，梅毒重組融合蛋白Tp0453-Gpd可作為梅毒診斷試劑抗原和梅毒疫苗的候選蛋白，但現(xiàn)階段融合蛋白表達(dá)水平還有待提高，此外，對更大量血清樣本的檢測，融合蛋白刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗體對梅毒的中和作用是下一步研究的內(nèi)容.