陸光輝， 褚志華**， 曾守逵， 李春美， 楊潔， 游浩

(1.湖北民族大學(xué)附屬民大醫(yī)院 檢驗(yàn)科， 湖北 恩施 445000； 2.江漢大學(xué)第一附屬醫(yī)院， 湖北 武漢 430000)

類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)以全身性炎癥及骨膜炎為主要臨床表現(xiàn)，血清學(xué)檢查時(shí)可查出自身抗體[1]。目前，RA病因及發(fā)生機(jī)制尚未完全清楚，有研究指出，各種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子直接或間接參與了RA發(fā)生及進(jìn)展過(guò)程[2]。Nod樣受體蛋白3(nod-like receptor family pyrin domain containing 3，NLRP3)炎癥小體作為NOD樣受體分子，由NLRP3、半胱氨酸蛋白酶1(Caspase-1)和凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein，ASC)組成，在機(jī)體固有免疫應(yīng)答及非感染性炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[3]，它能夠通過(guò)調(diào)控Caspase-1活化而促進(jìn)白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)成熟分泌；此外，IL-1β作為一種促炎介質(zhì)，在自身炎癥性疾病發(fā)生及進(jìn)展中起著關(guān)鍵性作用[4]。本研究通過(guò)分析RA患者外周血中NLRP3炎癥小體和IL-1β表達(dá)變化，探討其在RA病情評(píng)估及診斷中的意義。

1 資料與方法

1.1 資料

選取2015年2月～2016年8月就診的RA患者106例作為RA組，男34例、女72例，30～72歲、均(60.68±12.34)歲，所有患者均符合美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)學(xué)會(huì)/歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟(ACR/EULAR)關(guān)于RA診斷標(biāo)準(zhǔn)，排除心肝腎等重要臟器嚴(yán)重功能不全、惡性腫瘤、急慢性感染、其他自身免疫性疾病及結(jié)締組織病、以及孕婦或哺乳期婦女。選取同期骨性關(guān)節(jié)炎患者40例作為非RA組，男15例、女25例，32～74歲、平均(62.84±11.87)歲，均符合骨性關(guān)節(jié)炎相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)，排除標(biāo)準(zhǔn)同RA。選取健康體檢者60例作為對(duì)照組，男24例、女36例，29～71歲、平均(58.90±8.99)歲。本研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(醫(yī)院倫理委員會(huì)批號(hào)JYK201408160328)，所有研究對(duì)象均行知情同意。

1.2 方法

1.2.1血標(biāo)本采集 RA組與非RA組于入院后第2天清晨、對(duì)照組于體檢當(dāng)日清晨采集空腹靜脈血10 mL，分裝于EDTA抗凝血管和常規(guī)管內(nèi)各5 mL。利用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，PBS沖洗后，保存于-80 ℃冰箱，用于檢測(cè)NLRP3、Caspase-1和ASCmRNA表達(dá)；常規(guī)管內(nèi)外周血離心后分離血清，保存于-80 ℃冰箱，用于檢測(cè)IL-1β。

1.2.2NLRP3、Caspase-1和ASCmRNA表達(dá) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)，細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，按Trizol總RNA提取試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)說(shuō)明提取總RNA，利用紫外分光光度計(jì)(UV759S，購(gòu)自上海精密儀器儀表公司)檢測(cè)總RNA純度，A260/A280為1.80～2.20。使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(StepOnePlus，購(gòu)自美國(guó)ABI公司)按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(購(gòu)自美國(guó)Promega公司)操作步驟將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按PCR試劑盒(美國(guó)Promega公司)說(shuō)明對(duì)引物擴(kuò)增。NLRP3、Caspase-1、ASC及GAPDH(內(nèi)對(duì)照)引物序列及產(chǎn)物大小見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s循環(huán)38次。用2-△△Ct法計(jì)算外周血單個(gè)核細(xì)胞中NLRP3、Caspase-1和ASCmRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3血清IL-1β水平 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法檢測(cè)，試劑盒購(gòu)自自南京建成生物研究所，所有操作均按試劑盒說(shuō)明在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2.4RA患者病情指標(biāo) 記錄反映RA患者病情的臨床評(píng)估指標(biāo)，包括C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)、紅細(xì)胞沉降率(erythrocyte sedimen-tation rate，ESR)、抗環(huán)瓜氨酸肽(anti-cyclic citrullinated peptide，CCP)抗體和類(lèi)風(fēng)濕因子(rheumatoid factor，RF)水平。根據(jù)文獻(xiàn)[5]計(jì)算疾病活動(dòng)性積分(disease activity score 28，DAS28)，按DAS28評(píng)分大小將RA患者分為低活動(dòng)期(<3.2分)、中活動(dòng)期(3.2～5.1分)和高度活動(dòng)期(≥5.1分)[6]，比較不同活動(dòng)期RA患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中NLRP3、Caspase-1和ASCmRNA相對(duì)表達(dá)量及血清IL-1β水平。采用Pearson相關(guān)分析RA患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中NLRP3及血清IL-1β水平與其他臨床指標(biāo)相關(guān)性，采用多元線性回歸分析DAS28評(píng)分影響因素。

表1 NLRP3、Caspase-1、ASC及GAPDH引物序列及產(chǎn)物大小Tab.1 Sequence and Product size of NLRP3,Caspase-1,ASC and GAPDH primers

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般資料

3組研究對(duì)象的年齡和性別比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；RA組患者的CRP、ESR、CCP和RF均高于非RA組和對(duì)照組，非RA組患者 CRP和ESR高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各組研究對(duì)象一般資料比較Tab.2 Comparison of general information of subjects in each group

(1)與對(duì)照組比較，P<0.05；(2)與非RA組比較，P<0.05

2.2 外周血NLRP3、Caspase-1 和ASC mRNA相對(duì)表達(dá)量及血清IL-1β水平

RA組患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中NLRP3、Caspase-1和ASCmRNA相對(duì)表達(dá)量和血清IL-1β水平高于非RA組和對(duì)照組，非RA組高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

組別nmRNA相對(duì)表達(dá)量NLRP3 Caspase-1 ASCIL-1β(ng/L)RA組1062.05±0.29(1)(2)1.84±0.17(1)(2)1.72±0.24(1)(2)10.31±2.07(1)(2)非RA組401.54±0.12(1)1.47±0.12(1)1.30±0.09(1)6.11±1.13(1)對(duì)照組601.04±0.071.05±0.041.02±0.052.14±0.80 F426.982 645.750 302.157 493.982 P0.0000.0000.0000.000

(1)與對(duì)照組比較，P<0.05；(2)與非RA組比較，P<0.05

2.3 不同分期RA患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中NLRP3、Caspase-1和ASC mRNA相對(duì)表達(dá)量和血清IL-1β水平

高度活動(dòng)期RA組患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中NLRP3、Caspase-1和ASCmRNA相對(duì)表達(dá)量和血清IL-1β水平均高于中活動(dòng)期和低活動(dòng)期，中活動(dòng)期又高于低活動(dòng)期，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表4。

組別nmRNA相對(duì)表達(dá)量NLRP3 Caspase-1ASCIL-1β(ng/L)高度活動(dòng)期282.43±0.10(1)(2)2.05±0.14(1)(2)2.00±0.12(1)(2)12.32±1.53(1)(2)中活動(dòng)期372.09±0.13(1)1.81±0.08(1)1.79±0.10(1)10.95±1.42(1)低活動(dòng)期411.76±0.081.71±0.071.47±0.108.37±0.86 F361.249 105.773 223.079 87.805 P0.0000.0000.0000.000

(1)與對(duì)照組比較，P<0.05；(2)與非RA組比較，P<0.05

2.4 RA組患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中NLRP3表達(dá)和血清IL-1β水平與其他臨床指標(biāo)的相關(guān)性

相關(guān)分析顯示，RA組患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中NLRP3表達(dá)量和血清IL-1β水平均與Caspase-1 mRNA、ASCmRNA、CRP、ESR、RF和DAS28評(píng)分呈正相關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)表5。

表5 RA組患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中NLRP3表達(dá)和血清IL-1β水平與其他臨床指標(biāo)相關(guān)性(r，n=106) Tab.5 Correlation between the expression of NLRP3 and serum level of IL-1β in peripheral blood mononuclear cells of RA patients and other clinical indicators

注：(1)P<0.05

2.5 RA組患者DAS28評(píng)分影響因素分析

以DAS28評(píng)分為因變量，以RA組患者的年齡、CRP、ESR、CCP、RF、NLRP3 Mrna相對(duì)表達(dá)量、Caspase-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量、ASCmRNA相對(duì)表達(dá)量和血清IL-1β水平為自變量進(jìn)行多元線性回歸分析，結(jié)果顯示，RA組患者的CRP、RF和NLRP3 mRNA表達(dá)量是其DAS28評(píng)分的影響因素(P<0.05)，見(jiàn)表6。

表6 RA組患者DAS28評(píng)分影響因素的多元線性回歸分析Tab.6 Multiple linear regression analyze on influencing factors of DAS28 score of RA patients

3 討論

RA作為女性高發(fā)的一種自身免疫性疾病，可破壞關(guān)節(jié)及周?chē)M織，損傷關(guān)節(jié)功能，具有較高的致殘率，若早期未進(jìn)行規(guī)范化治療，3年內(nèi)70 %左右的患者會(huì)出現(xiàn)關(guān)節(jié)受損[7]，嚴(yán)重影響了患者生活質(zhì)量。既往研究發(fā)現(xiàn)，免疫炎癥反應(yīng)在RA發(fā)病過(guò)程中起著關(guān)鍵性作用，細(xì)胞因子參與及介導(dǎo)了RA滑膜病變過(guò)程[8-9]。NLRP3炎癥小體是炎癥反應(yīng)的核心，與多種疾病發(fā)生及進(jìn)展密切相關(guān)[10]，NLRP3、Caspase-1和ASC是NLRP3炎癥小體主要組成成分，NLRP3主要存在于單核巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞及一些初級(jí)免疫細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中[11-12]。正常情況下，NLRP3炎癥小體以非活性狀態(tài)存在于機(jī)體，一旦受到病原微生物或機(jī)體內(nèi)危險(xiǎn)信號(hào)刺激時(shí)迅速活化，通過(guò)調(diào)控Caspase-1活性對(duì)IL-1β等炎癥因子前體進(jìn)行切割，促使其成熟并釋放至胞外，從而引發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)[13-14]。本研究結(jié)果顯示，RA組外周血單個(gè)核細(xì)胞中NLRP3、Caspase-1和ASCmRNA相對(duì)表達(dá)量和血清IL-1β水平均高于非RA組和對(duì)照組，提示NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可能參與了RA發(fā)病過(guò)程。

CRP和ESR是反映自身免疫性疾病活動(dòng)性重要指標(biāo)，CCP和RF則是RA主要臨床診斷指標(biāo)[15]。本研究結(jié)果顯示，RA組CRP、ESR、CCP和RF高于非RA組和對(duì)照組，相關(guān)分析顯示RA患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中NLRP3表達(dá)量和血清IL-1β水平均與Caspase-1、ASC、CRP、ESR和RF呈正相關(guān)，提示RA患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中NLRP3 mRNA表達(dá)量和血清IL-1β水平與患者活動(dòng)性有關(guān)，提示這兩個(gè)指標(biāo)有望成為RA診斷指標(biāo)。DAS28作為評(píng)價(jià)RA病情的重要指標(biāo)，評(píng)分越高則病情越嚴(yán)重[16]。本研究結(jié)果顯示，高度活動(dòng)期RA患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中NLRP3、Caspase-1和ASCmRNA相對(duì)表達(dá)量和血清IL-1β水平均高于中活動(dòng)期和低活動(dòng)期，中活動(dòng)期高于低活動(dòng)期，說(shuō)明NLRP3炎癥小體通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)與RA病情密切相關(guān)，參與了患者病情進(jìn)展過(guò)程。此外，RA組患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中NLRP3 mRNA相對(duì)表達(dá)量和血清IL-1β水平均與DAS28評(píng)分呈正相關(guān)，NLRP3 mRNA表達(dá)量是DAS28評(píng)分的影響因素之一，提示RA患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中NLRP3 mRNA表達(dá)量和血清IL-1β水平可作為評(píng)估患者病情的指標(biāo)。

綜上所述，RA患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中NLRP3 mRNA表達(dá)量和血清IL-1β水平升高，且與患者病情嚴(yán)重程度有關(guān)，提示NLRP3炎癥小體通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)參與了RA發(fā)生進(jìn)展過(guò)程，有望為RA診斷及病情評(píng)估提供新的指標(biāo)。